早期宫颈癌患者外周血中HtrA1和HMGB1基因的表达及其临床意义

赵雪春

早期宫颈癌患者外周血中HtrA1和HMGB1基因的表达及其临床意义

赵雪春

目的探讨早期宫颈癌患者外周血中HtrA1、HMGB1基因的mRNA和蛋白水平的表达及其临床意义。方法选择2007年7月至2013年6月期间，广西壮族自治区脑科医院妇产科收治的早期宫颈癌患者的住院病例60例为实验组，同时以30例子宫肌瘤患者和30例健康志愿者为阴性对照组，30例晚期(ⅡB～ⅢB)宫颈癌患者为阳性对照组。采集患者的外周血并分离出白细胞，通过实时定量PCR和免疫组织化学检测外周血、病灶组织及淋巴转移灶组织中HtrA1和HMGB1在mRNA和蛋白表达水平的表达，分析其与临床病理参数、预后的相关性。结果与阴性对照组相比，实验组和阳性对照组患者外周血HTRA1和HMGB1 mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。实时定量PCR检测结果显示，实验组HtrA1和HMGB1 mRNA 表达水平高于阴性对照组，疾病组中发生宫颈癌转移的淋巴组织HtrA1和HMGB1表达水平高于未发生转移的淋巴组织，差异均具有统计学意义(P<0.05)。病理结果同样显示发生淋巴结转移的患者淋巴组织中HtrA1和HMGB1的表达量高。结论宫颈癌根治术前外周血HTRA1和HMGB1 mRNA表达水平可作为诊断早期宫颈癌循环肿瘤细胞的标志物，可能作为预测复发转移、判断预后的辅助指标。

宫颈癌；淋巴转移；HtrA1；HMGB1

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:1602～1605)

全世界的宫颈癌患者的病例达到1百万以上，作为世界第三大恶性肿瘤和第四大致死率肿瘤，对其相关机制的研究日益紧迫[1]。在美国等西方发达国家，尽管各种检查设备和医疗技术水平的提高，包括各种手术和化疗水平的提高，宫颈癌仍然是这些国家的第二妇科致死率肿瘤，每年大量的患者因此死亡[2]。虽然这方面的报道越来越多,但是诱导癌症产生的机制尚未揭示,因此这项研究对于揭示癌症与炎症的关系至关重要。最近的研究工作显示,免疫相关的细胞、细胞因子以及其它免疫相关的调节因子实际上在宫颈癌发生的每一个过程中都起着重要的作用,涉及癌症的启动、发生、发展以及转移等各个阶段[3-4]。本文就HtrA1和HMGB1和肿瘤的关系来讨论相应的癌症发生，尤其是宫颈癌发生的相关性问题。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选择2007年7月至2013年6月期间，广西脑科医院妇产科收治的术后病理确诊为早期宫颈癌的60例住院患者，年龄32～76岁，平均(45.5±9.6)岁，收集完整病史，对其临床病理资料进行分析。记录患者的症状及持续时间。所有患者术前均接受妇科检查，常规血液检查以及彩色多普勒超声检查，以搏动指数(PI)≤1，阻力指数(RI)≤0.55作为超声提示肿瘤血供丰富的指标[1]。完善相关检查后，所有患者均接受手术治疗。术中标本送病理科室进行检查，根据病理检验结果以及向家属告知病情后部分病例调整手术方案。术后标本进行石蜡包埋病理切片检查明确诊断。术后定期随访，如有复发，记录复发时间以及再次手术的时间和手术方案。同时以30例子宫肌瘤患者和30例健康志愿者为阴性对照组，年龄25～78岁，平均(42.7±10.3)岁；30例晚期(ⅡB～ⅢB)宫颈癌患者为阳性对照组，年龄33～77岁，平均(46.9±8.8)岁。

1.2 血液总RNA 提取

收集新鲜的外周血，分离出白细胞，用Trizol提取的患者和对照组的血液总RNA，质检电泳测序合格后，保存于-20 ℃冰箱备用，可以用于下一步的实时定量PCR检测。

1.3 Real-time PCR

提取淋巴外周血白细胞中的总RNA,逆转录反应生成cDNA,进行 Reltime PCR 反应,使用SsoFastTMEvaGreen®Supermix 检测。 反应体系为：SsoFastTMEvaGreen®Supermix 10 μl；上游引物(10 μM) 1 μl；下游引物(10 μM) 1 μl；cDNA 1 μl；3dH2O 7 μl共20 μl。反应条件：(1)95 ℃ 1 min；(2)95 ℃ 5 s；(3)58 ℃ 5 s +读板；(4)回到第二步，39个循环；(5)溶解曲线：65 ℃到95 ℃,每0.2 ℃，读板。每个样品设3个平行孔。CFX96实时荧光定量PCR 仪进行扩增，△△Ct 法检测各组样品中目的基因的相对表达量。

1.4 石蜡组织切片的HE染色

病理科取材并制备宫颈癌病灶组织石蜡包埋块，包埋后的组织经过4 μm 切片，制备相应的石蜡切片用于后续染色实验。石蜡切片经过二甲苯脱蜡，然后经各级乙醇脱水至水洗。用配制好的苏木精染色5 min，染色完毕后，自来水冲洗干净。置配置好的伊红液中染色2 min。经过常规脱水，透明，封片后于显微镜下镜检并获取不同的视野拍照，记录病理染色结果。

1.5 免疫组织化学法

组织经10%中性甲醛固定,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋、切片。切片常规脱蜡水化，0.3%过氧化氢处理10 min，柠檬酸盐缓冲液加热修复抗原，正常羊血清封闭，分别滴加抗HTRA1和HMGB1抗体，4 ℃孵育过夜。PBS 洗3遍，加生物素化二抗，37 ℃，30 min；清洗后，加辣根酶标记链霉卵蛋白素工作液， 37 ℃，30 min；DAB显色；自来水中淋洗；苏木精浸泡10 min；自来水淋洗；盐酸酒精分化；自来水淋洗；热水中浸泡，染化；梯度酒精脱水；晾干，中性树脂封片。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 早期宫颈癌患者根治术前外周血HTRA1和HMGB1 mRNA表达水平

与早期宫颈癌实验组相比，良性肌瘤患者与正常对照组外周血HTRA1和HMGB1 mRNA明显表达减少(P<0.05)，而晚期宫颈癌阳性对照组患者外周血HTRA1和HMGB1 mRNA表达水平明显升高(P<0.05)，说明HTRA1和HMGB1在宫颈癌早期的发生和晚期的发展过程中都扮演了极其重要的作用，见表1。

表1 实时定量RT-PCR检测实验组与对照组外周血HTRA1和HMGB1 mRNA表达水平

注：*为与实验组比较，P<0.01；△为与阴性组比较，P<0.01。

2.2 HtrA1和HMGB1在宫颈癌病灶组织中的mRNA水平

实验组和对照组宫颈癌病灶组织中HTRA1和HMGB1的mRNA 实时定量PCR 检测结果与免疫组化结果相一致,实验组中病灶组织HTRA1和HMGB1表达高于阴性对照组,具有显著差异(P<0.05)。实验组中发生宫颈癌转移的淋巴组织中HTRA1和HMGB1表达也高于未发生宫颈癌转移的淋巴组织中(P<0.05)。见图1。

a：实验组；b：阴性对照组；c：阳性对照组。

2.3 HTRA1和HMGB1在淋巴组织中的表达

利用免疫组化的方法比较阴性对照组与实验组淋巴组织中HTRA1和HMGB1的表达，图2显示，晚期宫颈癌患者的淋巴组织的HTRA1和HMGB1的表达均高于良性肌瘤患者对照组。早期60例宫颈癌患者中，30例宫颈癌淋巴转移灶患者的HTRA1和HMGB1的表达均高于未发生淋巴转移灶宫颈癌患者。这些结果显示，HTRA1和HMGB1的高表达可能与宫颈癌淋巴转移的过程相关。

a：实验组；b：阴性对照组；c：阳性对照组。

2.4 宫颈癌细胞的淋巴结转移病理检查

发生淋巴结转移的30例宫颈癌患者经影像学、解剖及病理检查证实淋巴成瘤,另有30例宫颈癌患者只至观察期终止时未发现淋巴成瘤。阴性对照组实验中，无宫颈癌的发生。实验组中，对取出的患者淋巴进行的HE染色结果显示，证实发生宫颈癌细胞的转移及破坏淋巴的能力。

2.5 HTRA1和HMGB1在宫颈癌转移淋巴组织中的表达

利用免疫组化的方法比较实验组与对照组淋巴组织的HTRA1和HMGB1的表达量，结果显示，实验组中发生转移的淋巴组织中，HTRA1和HMGB1的表达明显低于对照组患者淋巴组织；并且实验组中未发生转移患者的淋巴组织中的HTRA1和HMGB1的表达也明显低于转移的患者的淋巴组织。

3 讨论

关键调控蛋白与肿瘤的关系，除了提及的蛋白外，还包括趋化因子(chemokines),环氧化酶(COX-2),NF-kB2,低氧诱导因子(HIF-1alpha) 和 STATs 等一系列蛋白因子。因此这些蛋白的表达和肿瘤的发生存在密切的相关性，并在这个相关的过程中伴随着一系列的蛋白因子和相关通路。对这些相关蛋白因子和通路的分析有助于我们加深对肿瘤发生发展过程中的关键调控蛋白的认识，也有助于我们从分子水平和角度来认识和治疗炎症相关的癌症[5]。宫颈癌是一种最严重的妇科疾病，HTRA1和HMGB1在这过程中起着重要的调节作用，并且越来越多的证据显示HTRA1和HMGB1可以作为一种主要的调节子在宫颈癌的发生中扮演着极其重要的作用[6]。虽然目前对宫颈癌的认识有一定的进步，但是它仍然是高致死性的癌症，说明其中还有待我们进一步的研究和认识，肿瘤细胞假说，可能有助于我们对宫颈癌发生的相关认识，因为实验证明，宫颈癌的某些分型细胞在肿瘤的发生过程中扮演着重要的作用[7]。

侵袭转移是恶性肿瘤的重要生物学特性之一，是恶性肿瘤难以治愈的关键因素。许多证据显示HSP与肿瘤的侵袭转移方面密切相关，如Jaattela等的研究HSP27的过表达会在一些生物中提高同源细胞的致癌潜能，也会提高哺乳动物腺癌细胞的转移能力[8]；Rousseau等发现HTRA1和HMGB1被抑制后可以抑制肿瘤细胞生成和移动[9]；Rutherford等的实验也发现HTRA1和HMGB1功能被抑制后可以抑制E的甲状腺癌细胞的侵袭转移能力[10]。本实验中， 宫颈癌淋巴转移模型组中，免疫组化和Real-time PCR 结果均显示发生淋巴转移的淋巴组织中HTRA1和HMGB1的表达量均高于正常淋巴组织(Fig2)， 提示，HTRA1和HMGB1可能与患者宫颈癌淋巴转移有关。进一步，利用HTRA1和HMGB1 抑制剂17-AAG进行实验，发现，17-AAG在抑制HTRA1和HMGB1表达量的同时，明显抑制了宫颈癌淋巴转移能力，并且HE染色显示17-AAG降低淋巴组织被破坏的程度， 因此，这些实验结果证实了HTRA1和HMGB1 在宫颈癌淋巴转移过程中的作用，表明HTRA1和HMGB1表达水平的升高与癌症转移有密切关系。

HTRA1也是一个研究相当多的细胞因子，它在各种肿瘤中都具有比较高的表达，包括在宫颈癌中具有高表达，说明HTRA1在宫颈癌的发生和发展中具有促进作用，但是具体的作用机制并不清楚，但是HTRA1在Th17细胞的分化和增殖中具有重要作用[11-12]。而Th17能够生同属HTRA1家族的蛋白，具有抑制肿瘤的作用。另外一个关键作用蛋白HMGB1，在宫颈癌的病理发生中起着极其重要的作用，通过迁移，调节关键转录因子的平衡，同时影响宫颈黏膜屏障的完整性[13]。

综上所说，HTRA1和HMGB1在肿瘤的发生过程中均具有一定的功能。这些蛋白在肿瘤细胞的生长、增殖中发挥着重要作用，甚至决定性作用。因此，我们推测本实验中HTRA1和HMGB1可能是通过下游受体蛋白参与到宫颈癌细胞的淋巴转移过程中，但具体的分子机制需要进一步研究。

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(编辑：甘 艳)

Expression of HtrA1 and HMGB1 mRNA in Peripheral Blood of Early Cervical Cancer and its Clinical Significance

ZHAOXuechun.

Objective To investigate the expression of HtrA1 and HMGB1 mRNA in peripheral blood of early cervical cancer and Its clinical significance.Methods 60 cases of early(ⅠA2～ⅡA) cervical cancer patients were the experimental group，30 patients with uterine myoma and 30 healthy volunteers were the negative control group，30 cases of advanced(ⅡB～ⅢB) cervical cancer patients were the positive control group.Peripheral blood samples before radical resection in the experimental group，and the same samples before treatment of the control groups were collected.The change of expression level and positive rate of HTRA1 and HMGB1 in peripheral blood were analyzed using qRT-PCR technique，and its correlation with clinicopathological parameters and prognosis was further analyzed.Results Compared with the negative control group,the expression level of HTRA1 and HMGB1 mRNA in the peripheral blood of the experimental group and the positive control group were significantly higher than those of the negative control group (P<0.05).Real time quantitative PCR assay showed that the expression level of HtrA1 and HMGB1 mRNA in the experimental group was significantly higher than that of the negative control group,and the expression level of HtrA1 and HMGB1 mRNA in cervical cancer lymph nodes metastasis was significantly higher than that of the non metastatic lymph nodes (P<0.05).The pathological results showed that the expression of HtrA1and HMGB1 mRNA in patients with lymph node metastasis was higher.Conclusion Expression of HtrA1 and HMGB1 mRNA in peripheral blood before radical hysterectomy can be tumor markers in the diagnosis of early cervical cancer,and can be adjuvant indicators in predicting relapse,metastasis and prognosis.

Cervical cancer；Lymph metastasis；HtrA1；HMGB

545005 广西壮族自治区脑科医院

10.3969/j.issn.1001-5930.2015.11.006

R737.33

A

1001-5930(2015)11-1602-04

2015-07-20

2015-10-09)

TheGuangxiZhuangAutonomousRegionBrainHospital,Liuzhou,545005