基于PCR array技术探讨高脂血症大鼠肝脏AS信号通路相关基因mRNA表达

朱美林，贾连群，陈 阳，曹 媛，李 宁，李 静

(辽宁中医药大学 省部共建中医脏象理论及应用教育部重点实验室，辽宁 沈阳 110032)

基础医学研究

基于PCR array技术探讨高脂血症大鼠肝脏AS信号通路相关基因mRNA表达

朱美林，贾连群，陈 阳，曹 媛，李 宁，李 静

(辽宁中医药大学 省部共建中医脏象理论及应用教育部重点实验室，辽宁 沈阳 110032)

目的 利用PCR array技术检测高脂血症大鼠肝脏动脉粥样硬化(AS)信号通路相关基因mRNA水平，初步揭示上述基因表达变化与高脂血症发生的关系。方法 SPF级健康雄性SD大鼠30只，随机分为空白对照组和高脂血症组，高脂血症组给予高脂饲料喂饲造模。全自动生化分析仪检测血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，HE染色观察肝脏形态变化，油红O染色观察肝脏脂质沉积，提取各组大鼠肝脏总RNA，应用AS信号通路PCR芯片检测高脂血症大鼠肝脏AS信号通路相关基因mRNA表达。结果 与空白对照组相比，高脂血症组大鼠血清HDL-C水平显著降低，TC和LDL-C水平显著升高，肝细胞形成大量脂质沉积。PCR array 技术分析发现：与空白对照组相比，高脂血症组大鼠上调≥2倍的基因49个，占55%，如Serpinb2 (PAI-2)、Il2、Fga、Il5、Il4、Tnf、Cd44、Bid、Vwf、Mmp3、Icam1、Apob等基因；下调≥2倍的基因20个，占22%，如 Tgfb1、Vegfa、Lpl、Sod1、Fas、Pparg等基因，涉及应激反应、细胞凋亡、凝血、粘附分子、脂质转运与代谢、细胞生长和增殖以及转录调节等方面。结论 肝脏 AS信号通路相关基因mRNA表达变化可能与高脂血症发生有关。

胆固醇；高脂血症；PCR array；肝脏；信号通路

高脂血症是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的重要病理基础，大量的基础研究资料和临床实践证明: 高脂血症与AS的形成及冠心病(CHD)的发生发展关系极为密切[1-2]。有研究表明，AS 的危险因素累积得越多，其致 AS作用越强，发生心脑血管事件的概率越大[3]。不仅如此，有资料还显示， 心血管疾病已成为我国城乡的第一位死亡原因[4]。随着生活水平的逐步提高，目前高脂血症的发生率呈上升趋势[5]，从分子水平揭示高脂血症发生机理，为临床防治高脂血症提供实验室依据显得尤为重要[6]。本研究利用PCR array技术检测高脂血症大鼠肝脏AS信号通路相关基因mRNA水平，初步揭示上述基因表达变化与高脂血症发生的关系。

1 材料

1.1 实验动物 SD大鼠，SPF级，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，雄性，体重(300±10)g，合格证号SCXK(京)2012-0001。动物购进后，饲养环境温度为(25 ± 1)℃，自然光照，喂以正常饲料自由饮食，适应性饲养1周后，进入实验过程。

1.2 试剂与仪器 HE染色液购自北京鼎国生物技术公司；TG、TC、HDL-C、LDL-C、测定试剂盒(批号：0113011)，均购自四川迈新生物技术有限公司；油红O购自美国Sigma公司；Qiagen RNeasy Plus Mini kit；Qiagen RT2 First Strand kit；Qiagen RT2 SYBR Green ROX qPCRkit；Qiagen Atherosclerosis PCR Array；荧光显微镜(德国 Leica)；7500 Real Time PCR仪(Applied Biosystems，美国)；Veriti 96 well Thermal Cycler(Applied Biosystems，美国)；全自动生化分析仪(日本东芝)。

2 方法

2.1 分组、造模及标本采集 30只SD大鼠，随机分为空白对照组、高脂血症组。空白对照组予正常饲料喂养，高脂血症组予高脂饲料喂养，高脂饲料配方：6 %蔗糖、1 %谷氨酸钠、5 %蛋黄粉、8 %花生油、1.5 %胆固醇、0.4 %甲基硫氧嘧啶，78.1 %基础饲料。造模30 d，同时用高脂血症模型评估标准进行评价。实验前禁食12 h，称体重，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血5～10 mL，静置1～2 h，3 000 r/min离心10 min，分离血清，取上清液，低温(4 ℃)保存。取大鼠肝组织，切成小块，分别4%多聚甲醛固定及冷冻。

2.2 检测指标及方法

2.2.1 血脂检测 全自动生化分析仪测定血清中TG、TC、HDL -C、LDL -C 含量。

2.2.2 肝脏病理形态学观察 肝脏4%多聚甲醛溶液中固定24 h，按苏木素-伊红(HE)染色常规方法进行 70%～100%梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片(切片厚度5 μm) 、贴片、烤片后，用二甲苯脱蜡、70%～100%梯度酒精复水、苏木精染色、70% 盐酸酒精分色、伊红复染后，再用 70%～100% 梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片石蜡包埋，光学显微镜下观察肝脏形态。

2.2.3 油红O染色观察肝脏脂质沉积 肝脏样本制备冰冻切片( 6 μm) ，切片干燥后入50%乙醇水洗，油红O染色8 min，50%乙醇分化，自来水终止分化，苏木素复染，自来水反蓝，甘油明胶封片。光学显微镜下观察肝脏脂质沉积情况。

2.2.4 PCR芯片检测高脂血症 大鼠肝脏AS信号通路相关基因mRNA表达 100 mg 组织液氮研磨后加入1 mL Trizol 裂解，转移至1.5 mL离心管中，加入 0.2 mL氯仿，离心，吸取上层水相，加等量的异丙醇沉淀RNA，离心，缓慢加入75%乙醇洗涤，离心，空气风干后加入无RNA酶水溶解。紫外分光光度计测定260 nm 及280 nmOD值，计算 RNA 的浓度和纯度。取0.5 μg RNA 用于RT-PCR，按照PCR芯片试剂盒说明操作。

3 结果

3.1 各组实验大鼠血脂变化比较 与空白对照组比较，高脂血症组大鼠血清TC、LDL-C水平显著升高(P<0.01)，HDL-水平显著降低(P<0.01，见表1)。

组别空白对照组高脂血症组TG(mmol/L)0．87±0．150．70±0．05TC(mmol/L)1．55±0．111．86±0．22∗∗HDL-C(mmol/L)0．52±0．120．33±0．08∗∗LDL-C(mmol/L)0．65±0．461．43±0．13∗∗

与空白对照组比较，**P<0.01。

3.2 各组实验大鼠肝脏病理形态学及油红O染色改变 HE染色显示空白对照组大鼠肝细胞索排列正常，肝细胞形态正常，肝细胞无脂肪变性等异常改变，小叶内无炎细胞浸润。高脂血症组大鼠肝细胞脂肪变性明显，脂肪变性肝细胞体积增大，胞浆疏松，胞浆内含脂肪滴空泡，部分肝窦间隙变窄，可见炎细胞浸润。油红O染色高脂血症组大鼠脂肪变性肝细胞胞浆内见染为红色的脂肪滴(见图1)。

3.3 各组实验大鼠肝脏AS信号通路相关基因mRNA表达 芯片上包含84个与AS信号转导相关的基因，与空白对照组相比，高脂血症组大鼠上调≥2倍的基因49个，占55%，如 Serpinb2 (PAI-2)、Il2、Fga、Il5、Il4、Tnf、Cd44、Bid、Vwf、Mmp3、Icam1、Apob等基因；下调≥2倍的基因20个，占22%，如 Tgfb1、Vegfa、Lpl、Sod1、Fas、Pparg(见表2)。

A、C：空白对照组; B、D：模型组; A、B： ( HE染色×200) ;C、D：(油红O染色×400)。

表2 高脂血症组上调或下调2倍的基因及数值变化

GenesymbolGeneMeanfoldchange高脂血症组/空白对照组第1组：应激反应Il4Interleukin420．44↑TnfTumornecrosisfactor(TNFsuperfamily，member2)8．22↑Il2Interleukin225．23↑Tgfb1Transforminggrowthfactor，beta12．03↓Sod1Superoxidedismutase1，soluble8．02↓第2组：细胞凋亡BidBH3interactingdomaindeathagonist8．10↑VegfaVascularendothelialgrowthfactorA6．11↓Fas(Tnfrsf6)Fas(TNFreceptorsuperfamily，member6)8．22↓第3组：血液凝固和循环Serpinb2(PAI-2)Serpinpeptidaseinhibitor，cladeB(ovalbumin)，member226．96↑VwfVonWillebrandfactor7．69↑第4组：粘附分子Icam1Intercellularadhesionmolecule14．26↑Cd44Cd44molecule8．09↑第5组：细胞外分子Mmp3Matrixmetallopeptidase36．34↑Fga，Fibrinogenalphachain23．28↑Il5Interleukin520．95↑Lp1Lipoproteinlipase7．45↓第6组：脂质转运和运输ApobApolipoproteinB12．96↑第7组：转录调节PpargInterferongamma12．91↓

基因表达用PCR arry实验方法评估，上调：↑；下调↓。

4 讨论

现代医学认为，血脂代谢异常是AS、冠心病、脑卒中等心脑血管疾病的病理生理基础，脂类沉积和细胞内胆固醇聚集在AS形成过程中始终为主要因素[7]。大量研究表明，高脂血症可引起肝脏病变以及血管内皮功能发生障碍，导致单核细胞发生泡沫化，促进AS的发生[8]。医学研究表明血液中 的TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平异常是AS发生、发展的始动因素，心脑血管病的发病率与血清 TC及 LDL-C的浓度呈显著正相关[9-10]，HDL-C浓度与AS呈负相关[11]。提示其可能通过调节 TC、TG、LDL-C、HDL-C 等脂质代谢紊乱达到治疗AS的目的。

随着人们生活水平的提高，饮食结构的改变，高蛋白、高脂饮食增多，运动量减少，使得高血脂和动脉粥样硬化的发病率逐年增长，并且发病呈现年轻化趋势[12]。有研究发现，用添加有胆固醇、蛋黄粉、猪油等成分的高脂饲料喂养大鼠 4 周时，血清 TC、TG 和 LDL-C 水平就有明显升高[13]。本实验选用SD大鼠作为实验动物，用高脂饲料喂养8周建立实验性高脂血症动物模型。结果表明高脂饮食8周后出现稳定的血浆高脂水平，TC、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，与基础饮食大鼠血脂水平比较，其差异均具有统计学意义(P<0.05)。而且，肝脏脂质沉积与血清 TC、LDL-C 水平一致。这提示高脂血症不仅能够促进血浆脂代谢紊乱，而且可以导致肝脏脂质沉积，最终会导致AS的发生。结果证明，本实验模型建立成功。

基因芯片(gene chip)技术，又称DNA微阵列(microarray)，是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其基本原理是通过杂交检测信息[14]。基因芯片技术是随着基因组计划发展起来的生物技术，与传统方法相比，它具有快速、高通量、高准确性、低成本等特点，且其操作简单，易于标准化，适于推广，显示出广阔的临床应用前景[15]。本研究选用的Qiagen Atherosclerosis PCR Array芯片包含了信号通路的84个关键基因。

AS信号通路是一条与应激反应、细胞凋亡、凝血、粘附分子、脂质转运与代谢、细胞生长和增殖以及转录调节等方面的信号通路，因此，本研究主要应用PCR芯片检测高脂血症大鼠肝脏AS信号通路相关基因mRNA表达。对肝脏AS信号通路相关基因mRNA表达变化与高脂血症及AS发生机制进行初步探索。

本研究发现， 与空白对照组相比，高脂血症组上调≥2倍的基因49个，占55%。其中应激反应基因11个、细胞凋亡基因4个、血液凝固和循环基因3个、粘附分子基因10个、细胞外分子基因17个、脂质转运和代谢基因3个、细胞生长和增殖基因3个，如Serpinb2 (PAI-2)、Il2、Fga、Il5、Il4、Tnf、Cd44、Bid、Vwf、Mmp3、Icam1、Apob等基因；下调≥2倍的基因20个，占22%，其中细胞凋亡基因2个，粘附分子基因1个、细胞外分子基因3个、细胞生长和增殖基因2个、转录调节基因1个，如 Tgfb1、Vegfa、Lpl、Sod1、Fas、Pparg。研究表明这些相关基因的表达上调/下调，可以引起相应的效应分子的变化，从而引起高脂血症以及AS的发生。

我们的检测结果虽然能在一定程度上提供较多的关于高脂血症影响肝脏AS信号通路中相关基因mRNA表达变化的信息，但是这些信息之间的相互关系以及各基因表达改变的实际意义尚不能给出明确解释，而且基因表达的变化还受到多种复杂因素的影响，这些问题尚需在后续的研究中进一步验证和探讨。

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[收稿2014-10-22;修回2014-12-21]

(编辑：谭秀荣)

The mRNA expression of the AS signaling pathway related genes in the liver of hyperlipidemia rats by PCR array technology

ZhuMeilin,JiaLianqun,ChenYang,CaoYuan,LiNing,LiJing

(Key Laboratory of Ministry of education, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang Liaoning 110032,China)

Objective To test the mRNA expression of AS signaling pathway related genes in the liver of hyperlipidemia rat by the method of PCR array, and to explore the relationship between the above-mentioned changes in gene expression and hyperlipidemia.Methods SD rats (30 males) were randomly divided into two groups: control group and model group. The rats in model group were fed with high fat diet. The content of TG, TC, HDL-C and LDL-C in serum were detected by automatic biochemical analyzer. HE and oil red staining method were used to observe the liver injury. Total RNA was extracted from liver in each group. PCR array was used to test the AS signaling pathway related genes in the liver.Results In model group the level of TC and LDL-C increased while the level of HDL-C decreased significantly compared to control group. Oil red staining indicated that obvious lipid deposition were formed in the liver cells in model group. DNA microarray showed that in model group the expression level of 49 (55%) genes (e.g. Serpinb2 (PAI-2), Il2, Fga, Il5, Il4, Tnf, Cd44, Bid, Vwf, Mmp3, Icam1, Apob, etc.) increased by more than 2-fold compared to control group; and the expression level of 20 (22%) genes (e.g. Tgfb1,Vegfa,Lpl,Sod1,Fas,Pparg, etc.) decreased by more than 50% compared to control group.Conclusion The mRNA expression of AS related genes may relate to the hyperlipidemia.

cholesterol;hyperlipidemia; PCR array technology;liver;signal transduction

国家自然科学基金青年项目(NO：81202834)；沈阳市科技局计划项目(NO：F12-277-1-49)。

贾连群，女，博士后，副教授，硕士生导师，研究方向：中药防治心血管疾病分子生物学机制，E-mail:jlq-8@163.com。

R589.2

A

1000-2715(2015)01-0037-04