PRDX2基因沉默促进结直肠癌细胞上皮-间质转化增强侵袭转移能力

于伟娜，冯继红，丁陈波，高绍莹，徐 林，袁建波，罗军敏

(1.遵义医学院免疫学教研室暨贵州省免疫学研究生教育创新基地，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院附院附属肿瘤医院，贵州 遵义 563099；3.遵义医学院 医学检验系2011级学生，贵州 遵义 563099)

临床医学研究

PRDX2基因沉默促进结直肠癌细胞上皮-间质转化增强侵袭转移能力

于伟娜1，冯继红2，丁陈波1，高绍莹1，徐 林1，袁建波3，罗军敏1

(1.遵义医学院免疫学教研室暨贵州省免疫学研究生教育创新基地，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院附院附属肿瘤医院，贵州 遵义 563099；3.遵义医学院 医学检验系2011级学生，贵州 遵义 563099)

目的 探讨Peroxiredoxin 2(PRDX2)基因沉默在结直肠癌细胞上皮-间质转化(EMT)中的作用及其参与侵袭转移的可能机制。方法 将带有抗性的对照shRNA(shRNA-Control)和PRDX2 shRNA(shRNA-PRDX2)慢病毒颗粒分别转染结直肠癌SW480细胞，转染后细胞分为PRDX2沉默组(shRNA-PRDX2)和空载对照组(shRNA-Control)。采用免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法分别检测两组细胞中PRDX2蛋白和mRNA表达；以5 ng/mL的TGF-β1作用两组细胞，在0、48、72 h观察两组细胞形态学变化；划痕实验和Transwell小室分别检测两组细胞体外迁移和侵袭能力；Western blot和qRT-PCR法检测E-cadherin、Vimentin、Snail、Twist1和MMP-9蛋白及mRNA表达。结果 与对照组相比，PRDX2 沉默组细胞PRDX2蛋白和mRNA的表达显著降低(P<0.05)，成功建立PRDX2基因沉默稳定细胞株；经TGF-β1作用后，PRDX2沉默组细胞呈纺锤体样间质细胞表型，且迁移和侵袭能力明显增强；E-cadherin蛋白及mRNA水平表达显著下降，Vimentin、Snail、Twist1和MMP-9蛋白及mRNA表达水平均明显增加(P<0.05)。结论 PRDX2基因沉默可促进结直肠癌SW480细胞发生EMT，从而增强细胞的侵袭和转移能力，可能与其转录调节Snail、Twist1表达有关。

Peroxiredoxin 2；基因沉默；结直肠癌；上皮-间质转化；侵袭转移

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，是导致癌症相关死亡的第4大主要原因，仅次于肺癌、胃癌和肝癌[1]。最新GLOBOCAN数据显示全球每年大约有120万新确诊病例，并且有超过60万名患者死于CRC[2]。CRC在欧洲、北美和大洋洲较为多发，其发病率约在45.7/10万[3]。我国也处在CRC的相对较高发地区，据统计分析其发病率为29.44/10万，死亡率为14.23/10万，且5年生存率为60%左右[4]。尽管目前外科手术、放化疗可有效提高患者的生存率，但大部分患者最终还是死于转移和局部复发。肿瘤转移过程中上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)起到了关键性的作用，且肿瘤微环境中多种转录因子可参与调控EMT过程[5]。TGF-β1作为一个多功能的细胞因子，是目前已知的诱导肿瘤细胞发生EMT的关键细胞因子[6]。硫氧还蛋白过氧化物酶2(peroxiredoxin 2，PRDX2)是近年新发现的一类过氧化酶，广泛存在于原核和真核生物中。研究发现PRDX2在多种肿瘤细胞及组织中高表达，从而参与肿瘤的细胞增殖、凋亡以及侵袭转移。我们前期研究发现PRDX2高表达于结直肠癌组织中，与淋巴结转移密切相关[7]；而且，过表达的PRDX2可抑制人结直肠癌细胞的迁移和EMT的发生[8]，然而对于PRDX2基因沉默对人结直肠癌细胞SW480细胞EMT及转移的影响却鲜有报道。本研究前期利用TGF-β1成功诱导SW480细胞发生EMT[9]，在此基础上在SW480细胞内利用PRDX2 shRNA慢病毒载体沉默PRDX2基因，观察PRDX2基因沉默对细胞EMT过程和侵袭转移影响及相关机制，为针对结直肠癌的靶向治疗提供新的线索和契机。

1 材料与方法

1.1 材料 人结直肠癌Dukes B期细胞株SW480购自中科院上海细胞库；PRDX2shRNA慢病毒载体及对照载体Control shRNA购自上海吉凯基因化学技术有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自杭州四季青公司；Leibovitz’s L-15(L-15)培养基购自Gibco公司；0.25%胰酶(含EDTA)购于Solarbio公司；单克隆兔抗人E-cadherin、Vimentin购自Abcam公司；兔抗人Twist1、Snail和MMP-9抗体购自Santa Cruz公司；嘌呤霉素(puromycin)购自Sigma公司；全蛋白提取试剂盒购自凯基生物科技有限公司；ECL试剂盒、鼠抗人β-actin、辣根过氧化物酶( HRP) 标志的羊抗兔IgG二抗、DAPI染色液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自Beyotime公司；TGF-β1购自Peprotech公司；FastQuant cDNA第一链合成试剂盒购自天根生化科技有限公司；Trizol、SYBR®Premix Ex TaqTMII购自TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SW480细胞在含10%FBS的L-15培养基中，37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱培养。

1.2.2 细胞转染与分组 取对数生长期SW480细胞，以2×105/孔接种于6孔板中，次日根据SW480细胞MOI值计算所需PRDX2 shRNA及对照shRNA病毒颗粒数，分别加入各孔中，培养28 h后更换嘌呤霉素筛选培养基(3 μg/mL)，继续抗性筛选培养3周建立稳定转染细胞株，通过Western blot和qRT-PCR对转染效果进行鉴定。实验设空载对照组(shRNA-Control)和PRDX2沉默组(shRNA-PRDX2)。

1.2.3 细胞形态学观察 取两组处于对数生长期的细胞以2×105/孔密度接种于6孔板中，每组细胞设3复孔，待细胞贴壁后，更换含5ng/mL TGF-β1的L-15培养基，分别于0、48、72h在倒置相差显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.2.4 划痕实验 将处于对数生长期的两组细胞以5×105/孔密度接种于6孔板中，待细胞单层铺满后，用10 μL枪头分别在各组细胞上垂直划痕，经PBS洗涤后加入终浓度为5 ng/mL TGF-β1的含1% FBS的L-15培养基，分别于24、48、72 h 100倍倒置相差显微镜下观察划痕中细胞迁移情况并拍照，同时测量细胞划痕间距。

1.2.5 Transwell侵袭实验 取50 μLMatrigel胶包被小室基底膜上室，置于超净工作台过夜风干。使用前以100 μL/孔加入无血清L-15培养基，37 ℃孵育30 min使Matrigel胶重新水化。收集两组细胞，以含0.1% BSA的无血清L-15培养基重悬，调整细胞浓度为2.5×105个/mL，取各组细胞200 μL加入各小室，下室加入500 μL含5 ng/mLTGF-β1的L-15培养基，常规培养48 h后，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，倒置相差显微镜下随机选取5个视野拍照并计数。

1.2.6 Western blot检测 收集各组细胞，PBS洗涤后提取总蛋白并测定其浓度，上样，10%SDS- PAGE 凝胶电泳分离蛋白，电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。分别加入一定稀释比例的一抗，4 ℃孵育过夜，PBST漂洗3次，分别加入辣根过氧化物标记的羊抗兔/鼠二抗，室温孵育1 h，PBST漂洗3次，ECL显色，自动凝胶数字成像系统采集图像。

1.2.7 qRT-PCR检测 收集经和未经TGF-β1(5 ng/mL)诱导的shRNA-Control组和shRNA-PRDX2组细胞，使用Trizol分别提取各组细胞总RNA，检测RNA浓度并将其逆转录为cDNA，随后进行PCR循环扩增。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如表1。反应条件为：95 ℃，5 min预变性；95 ℃，20 s；60 ℃，1 min，扩增40个循环。2-ΔΔCT法计算mRNA的相对表达量，以GAPDH为内参。

表1 qRT-PCR引物序列

目的基因上游引物/下游引物PRDX2E-cadherinVimentinSnailTwist1MMP-9GAPDH5＇-CACCTGGCTTGGATCAACACC-3＇5＇-CAGCACGCCGTAATCCTCAG-3＇5＇-GCTCGGCCTGAAGTGACTCG-3＇5＇-CCGCTTCCTTCATAGTCAAACAC-3＇5＇-CCAGGCAAAGCAGGAGTCCAC-3＇5＇-GCTTCCTGTAGGTGGCAATCTC-3＇5＇-AGCCTGGGTGCCCTCAAG-3＇5＇-GAGCACACGCCTGGCACTG-3＇5＇-GTCCATGTCCGCGTCCCACATG-3＇5＇-ACGGGCCTGTCTCGCTTTCTC-3＇5＇-TGGTCCTGGTGCTCCTGGTG-3＇5＇-GCTGCCTGTCGGTGAGATTGG-3＇5＇-GAGCCAAACGGGTCATCATCT-3＇5＇-GAGGGGCCATCCACAGTCTT-3＇

1.2.8 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行统计分析，两组间均数比较采用t检验，不同时段蛋白表达比较采用单因素方差分析，有差异者Dunnett’s test行两两比较；经和未经TGF-β1诱导的两组细胞mRNA表达比较用两因素析因设计资料方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PRDX2 shRNA慢病毒对SW480细胞PRDX2表达的影响 将慢病毒载体shRNA-Control和shRNA-PRDX2转染SW480细胞后，Western blot和qRT-PCR法检测细胞内PRDX2蛋白和mRNA表达水平。结果显示，与对照组相比，PRDX2沉默组细胞PRDX2蛋白和mRNA表达水平均显著降低(P<0.05，见图1～2)。

图1 PRDX2基因沉默后SW480细胞中PRDX2蛋白表达

图2 PRDX2沉默后SW480细胞中PRDX2 mRNA表达

2.2 细胞形态学观察 与对照组相比，随着时间的变化， shRNA-PRDX2组细胞形态由鹅卵石样逐渐转变为纺锤体样间质细胞形态，且细胞间连接也逐渐消失，细胞变的松散，突起亦随之增多(见图3)。

2.3 PRDX2沉默后在TGF-β1作用下对细胞迁移能力的影响 shRNA-Control组和shRNA-PRDX2组细胞在5ng/mLTGF-β1诱导下，随着时间的推移，两组细胞的划痕间距均明显变窄，但在TGF-β1作用72 h后shRNA-PRDX2组细胞划痕间距明显低于shRNA-Control组，差异有统计学意义(P<0.05，见图4)。

图3 PRDX2沉默后在TGF-β1诱导下对SW480细胞形态学影响(×200)

图4 PRDX2沉默对TGF-β1作用后细胞迁移能力的影响(×100)

2.4 PRDX2沉默对TGF-β1诱导后SW480细胞侵袭能力的影响 侵袭实验结果显示，在5ng/mLTGF-β1诱导下shRNA-PRDX2组穿过人工基底胶细胞数明显多于shRNA-Control组(P<0.05，见图5)。

A:shRNA-Control组;B:shRNA-ARDX2组。

2.5 Western blot检测各组细胞中E-cadherin、Vimentin、Snail、Twist1和MMP-9蛋白的表达 在PRDX2基因沉默后，EMT标志分子E-cadherin的表达明显降低，而Vimentin、Snail、Twist1和MMP-9表达则明显升高(P<0.05)；随着TGF-β1诱导时间的延长，shRNA-PRDX2组细胞内E-cadherin蛋白表达水平明显低于对照组，Vimentin、Snail、Twist1和MMP-9表达较对照组显著增加(P<0.05，见图6)。

图6 Western blot检测各组细胞E-cadherin、Vimentin、Snail、Twist1及MMP-9蛋白表达

2.6 qRT-PCR检测各组细胞中E-cadherin、Vimentin、Snail、Twist1和MMP-9 mRNA表达情况 结果显示在PRDX2沉默后，shRNA-PRDX2组E-cadherin mRNA表达量明显降低，同时Vimentin、Snail、Twist1和MMP-9表达升高(P<0.05)；且在5ng/mLTGF-β1诱导后，shRNA-PRDX2组细胞内E-cadherin mRNA水平明显低于shRNA-Control组，同时Vimentin、Snail、Twist1和MMP-9 mRNA表达显著增加(P<0.05，见图7)。

主效应F值=11.82，交互效应F值=27.74，P值均<0.05。

3 讨论

结直肠癌是一种上皮细胞来源的恶性肿瘤，早期较易发生转移，Enquist等[10]通过建立小鼠模型研究发现结直肠癌肿瘤细胞能够在周围淋巴结蔓延之前直接转移到肝脏。肝转移是结直肠癌的主要转移途径，同时也是结直肠癌患者死亡的主要原因之一，因此探讨结直肠癌侵袭转移机制对其临床治疗与预后具有重要意义。

PRDX2作为PRDXs家族的一个重要成员，是一种重要的细胞内抗氧化剂。RRDX2可参与细胞的抗氧化防御系统，能有效的对抗氧化应激引起的细胞损伤，从而有利于肿瘤细胞的增殖和存活。近期研究发现PRDX2在肿瘤的侵袭转移过程中也发挥着重要的作用，Agrawal-Singh等[11]证实急性髓细胞性白血病细胞中PRDX2蛋白表达与临床不良预后以及转移呈负相关关系。另外，PRDX2的过度表达可通过增加E-cadherin/β-catenin复合物的形成从而抑制黑色素瘤的进展和转移[12]。本研究在TGF-β1诱导结直肠癌细胞产生EMT表型改变的前期基础之上，将shRNA慢病毒载体转染结直肠癌细胞使PRDX2基因沉默，观察PRDX2基因在结直肠癌细胞EMT及侵袭转移过程中的作用。结果发现，PRDX2基因沉默后SW480细胞发生了显著的生物学行为变化，同时EMT标志分子也有相应改变。倒置相差显微镜下观察细胞形态显示，PRDX2沉默后细胞逐渐由上皮形态向间质形态转变，细胞迁移与侵袭能力也明显增加；且经TGF-β1诱导后，PRDX2基因沉默组细胞呈典型间质细胞形态，细胞散在分布、突起增多，且细胞迁移、侵袭能力均显著增强，表明PRDX2基因沉默促进了结直肠癌细胞EMT过程并增强细胞的侵袭转移。

在肿瘤侵袭转移过程中，EMT起着关键性的作用。EMT可使上皮细胞转化为间质细胞状态，并发生一系列表型和分子的改变，促使细胞外基质成分产生降解，从而增强肿瘤细胞的迁移、侵袭能力。经历EMT的肿瘤细胞在到达合适的生长部位后又可经过间质-上皮转化(MET)重新获得上皮细胞特性进而增殖形成新的转移病灶。上皮细胞标记分子E-钙粘蛋白(E-cadherin)介导粘附的丢失常被认为是肿瘤细胞侵袭和转移的一个先决条件，且已有研究证实E-cadherin表达下调或缺失与EMT的发生密切相关，并能够促进肿瘤的侵袭与转移[13]。在肿瘤发生发展过程中肿瘤微环境中多种转录因子可参与调控EMT过程，如Snail、Twist1等。这些转录因子作为细胞间粘附分子E-cadherin的负性调控因子，可以竞争性的结合E-cadherin的启动子区域，在发挥对EMT的诱导效应中起到关键性作用[14]。Snail是一类锌指转录因子，研究表明Snail可抑制E-cadherin表达从而诱导EMT发生，与乳腺癌的侵袭转移密切相关[15]。碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)转录因子Twist1在胚胎发育和肿瘤进展中均发挥重要调控作用，且其介导的EMT可能参与卵巢癌的浸润[16-17]。有研究证实肺癌中异常表达的Snail、Twist1可以直接抑制E-cadherin的转录和翻译，从而诱使肿瘤细胞发生EMT[18]。本研究发现在PRDX2基因沉默后，EMT标志分子E-cadherin的表达显著降低，Vimentin、Snail、Twist1表达则明显升高；且在TGF-β1作用下，较对照空载组E-cadherin表达明显降低，同时Vimentin、Snail、Twist1表达显著增加，表明下调PRDX2的表达可促进结直肠癌SW480细胞EMT的发生，并且可能是通过转录调节Snail和Twist1来实现的。侵袭和转移是恶性肿瘤细胞的一个重要特征，细胞外基质(ECM)是肿瘤细胞转移的天然屏障。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类重要的蛋白水解酶，可由肿瘤细胞、内皮细胞等合成和分泌，能有效的降解ECM及基膜，在肿瘤的侵袭转移过程中占有重要角色[19]。MMP-9是MMPs中降解ECM的重要蛋白水解酶之一，其表达增加与肿瘤的浸润转移极为相关。MMP-9在多种肿瘤细胞、肿瘤组织中表达增强，且肿瘤细胞的高侵袭能力均与MMP-9的异常高表达有关[20-22]。同样，本研究也发现在PRDX2基因沉默后，无论TGF-β1诱导与否SW480细胞中MMP-9表达量均明显升高，且细胞的迁移、侵袭能力也显著增加，进一步说明PRDX2参与了结直肠癌细胞的侵袭和转移过程。目前研究发现肿瘤细胞中过表达的PRDX2可增强细胞的DNA修复能力，进而增加肿瘤细胞的化学抗性，促进肿瘤的进展[23-24]。对于这些不同的结果目前尚未有合理的解释，猜测PRDX2对于不同病理类型的肿瘤细胞可能存在着不同的作用，同样即使在同一肿瘤中其作用也可能截然不同。Shiota等[25]报道PRDX2在前列腺癌细胞的胞质和胞核中存在不同的作用，细胞质中过度表达的PRDX2可促进雄激素受体的激活，而在细胞核中的作用则反之。前期研究发现PRDX2高表达于CRC LoVo细胞株，且高表达的PRDX2能有效的抵抗H2O2诱导的细胞凋亡；且在SW480细胞的研究中初步发现PRDX2可抑制结直肠癌细胞的EMT进程和转移过程，并提示可促进MET过程的发生[8，26]。由此可见，PRDX2对肿瘤的发生发展具有相当复杂而严格的调控机制，可能在同一肿瘤中同时发挥致癌基因和抑癌基因的双重角色。因此，PRDX2调控结直肠癌细胞EMT和转移过程的作用机制仍需进一步研究探讨。

综上所述，PRDX2基因沉默促进TGF-β1诱导的结直肠癌SW480细胞发生EMT，从而增强了细胞的侵袭和转移，同时EMT标志分子E-cadherin、Vimentin以及相关转录因子Snail、Twist1也发生相应改变。由此我们可以看出PRDX2基因与结直肠癌细胞EMT的发生以及侵袭迁移均有着密切的联系，这一研究结果可为临床靶向基因治疗以及后期侵袭转移的机制探讨提供一定的实验数据。

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[收稿2014-12-10;修回2015-01-05]

(编辑：王福军)

Silencing of PRDX2 promotes epithelial-mesenchymal transition of colorectal cancer cells and enhances the abilities of invasion and metastasis

YuWeina1,FengJihong2,DingChenbo1,GaoShaoying1,XuLin1,YuanJianbo3,LuoJunmin1

(1.Department of Immunology , Immunology Innovation Base of Postgraduate Education of Guizhou Province , Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099，China;2.Cancer Hospital of The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China;3.Department of Medical Laboratory,Zunyi Medical University,Students of Grade 2011,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To explore the effects of PRDX2 silencing on epithelial-mesenchymal transition of colorectal cancer cells, and its underlying mechanism in invasion and metastasis.Methods Lentiviruses control shRNA (shRNA-Control) and PRDX2 shRNA (shRNA-PRDX2) with resistance were transfected respectively into colorectal cancer SW480 cells. The transfected cells were divided into PRDX2 silencing group (shRNA-PRDX2) and empty vector control group (shRNA-Control). The expressions of PRDX2 protein and mRNA in SW480 cells were examined by Immunoblot (Western blot) and quantitative real-time PCR (qRT- PCR). Under the treatment with 5 ng/ml TGF-β1, cell morphological alterations were observed at 0, 48, and 72 h. The cell migration and invasion capabilities were evaluated with wound healing assay and transwell chamber, respectively. The protein and mRNA expressions of E-cadherin, Vimentin, Snail, Twist1 and MMP-9 were detected by Western blot and qRT-PCR.Results Compared with control group, the expressions of PRDX2 protein and mRNA were significantly decreased in PRDX2 silencing group (P<0.05). PRDX2 silencing cell line was successfully constructed. The cells with PRDX2 silencing showed a spindle-like mesenchymal phenotype and the migration and invasion were significantly increased after treatment with TGF-β1. The expression of E-cadherin was significantly decreased, while the expressions of Vimentin, Snail, Twist1 and MMP-9 were significantly increased (P<0.05).Conclusion Silencing of PRDX2 promotes epithelial-mesenchymal transition possibly by regulating the expressions of Snail and Twist1 in colorectal cancer SW480 cells，and subsequently promotes cell invasion and metastasis.

Peroxiredoxin 2 (PRDX2)；gene silencing；colorectal cancer；epithelial-mesenchymal transition；invasion and metastasis

贵州省科学技术基金资助项目(NO：黔科合J字[2013]2312)；贵州省优秀科技教育人才省长基金资助项目(NO：黔科教办[2010]04)。

罗军敏，女，教授，硕士生导师，研究方向：肿瘤免疫，E-mail:luojm128@163.com。

R735.3

A

1000-2715(2015)01-0074-06