自组装短肽RAD16-I在水溶液中对疏水性化合物的稳定作用

唐富山，原凌燕，高冬芳，宋 鸿

(1.遵义医学院 临床药学教研室，贵州 遵义 563099；2. 遵义医学院 基础护理学教研窒，贵州 遵义 563099；3.遵义医学院 微生物学教研室，贵州 遵义 563099)

技术与方法

自组装短肽RAD16-I在水溶液中对疏水性化合物的稳定作用

唐富山1，原凌燕2，高冬芳1，宋 鸿3

(1.遵义医学院 临床药学教研室，贵州 遵义 563099；2. 遵义医学院 基础护理学教研窒，贵州 遵义 563099；3.遵义医学院 微生物学教研室，贵州 遵义 563099)

目的 研究自组装短肽RAD16-I在水溶液中对疏水性化合物的稳定作用。方法 观察模式疏水性化合物芘在RAD16-I水溶液中于磁力搅拌下形成胶体混悬液的情形，以动态光散射激光粒度仪测定混悬液中粒子的粒度分布，以荧光分光光度法表征芘在与RAD16-I形成的胶体混悬液中的存在形式并考察当此混悬液与卵磷脂(EPC)脂质体混合时，其中芘向模拟细胞的卵磷脂(EPC)脂质体的膜中释放的可能性。结果 在机械搅拌下，芘在RAD16-I水溶液中能形成相对稳定的混悬液，混悬液中粒子粒度为500～5000 nm，平均粒径为1800 nm，芘的荧光发射光谱和激发光谱都表明，芘在此混悬液中以微晶形式存在；当该混悬液与EPC脂质体溶液混合时，芘以分子形式扩散进入EPC脂质体膜中。结论 自组装短肽RAD16-I能在水性体系中稳定疏水性化合物，具有作为疏水性化合物和水难溶性药物载体的潜力。

自组装短肽；RAD16-I；疏水化合物；芘；荧光分光光度法

许多药物的水中溶解度很低，在生理的水性体液系统中存在传递问题，因而限制了其在临床的应用。许多经由高通量筛选出的活性化合物，由于溶解性能问题而无法进一步开发[1]。因而，开发临床可用的水难溶性药物载体材料具有十分重要的意义。材料只有与疏水性药物适当地相互作用，使得药物在水溶液中保持相对稳定，才能作为水难溶性药物载体材料被开发。生物技术和生物材料在现代药物载体材料开发中占有重要地位[2]，是现代药物载体材料开发的特色领域。由于离子互补型自组装短肽结构序列中具有交替出现的亲水和亲脂性氨基酸残基，其亲水亲油性适中，生物相容性和生物可降解性良好，而且可以相对容易地设计新的短肽或对现有短肽加以结构修饰[3-4]，而这些都是药物载体材料尤其是水难溶性药物载体材料开发所希望的。已有报道[5-6]表明EAK16-II能够在水溶液中稳定芘的微晶并将芘以分子形式传送到蛋黄卵磷脂(EPC)脂质体的脂双层膜中。

RAD16-I由系统替换EAK16-II中的带电氨基酸并将电荷分布类型由II型变为I型设计合成，在生物材料研究中比EAK16-II应用更为广泛。由于RAD16-I与EAK16-II一样能够在水溶液中形成β折叠的二级结构[3]，可以预期其疏水性区域可以与疏水性化合物相互作用而其亲水区域可以使疏水性化合物与短肽的复合体在水溶液中稳定。而其RAD序列与细胞粘附位点的RGD序列的高度相似性也许可以提供较好的细胞粘附能力。因此，本文参考文献[5]的方法，以芘为模型疏水性化合物，以EPC脂质体模拟细胞膜，研究RAD16-I在水性体系中对疏水性化合物的稳定作用。

1 仪器与试药

荧光分光光度计，F-4500型，日立公司；旋转蒸发仪，RE-2000型，上海亚荣生化仪器厂；动态光散射激光粒度仪，LB-550型，日本Horiba 公司；高速离心机，Allegra X-22R型，贝克曼公司；电子天平，0.1 mg，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；超纯水仪：Mini-Q，Millipore公司。

RAD16-I(PuraMatrixTM, Ac-RADARADARADARADA-CONH2, 1%w/v)，购自美国3DM公司；芘(Pyrene，PY)，购自Sigma Aldrich，临用前用乙醇重结晶二次；鸡蛋卵磷脂(Egg phosphatidylcholine ，EPC)，购自上海国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯，购自本地有关试剂公司；二次蒸馏去离子水，Milli-Q，通用于配制所用的水溶液。

2 实验操作

2.1 芘晶体的胶体混悬液制备与粒度测定 取适量芘晶体粉末，置于10 mL的玻璃小瓶中，精确称重，精密加入适当体积的水，然后精密加入适当体积提前超声30 min[7]的1% RAD16-I溶液，制成芘的浓度为5.0×10-3M、RAD16-I的浓度为0.1 mg/mL (5.8×10-5M)的RAD-PY溶液。RAD -PY溶液在室温下保持磁力搅拌，每天测定荧光发射光谱，溶液的荧光光谱在24 h之内基本不随时间变化时，则认为达到平衡。不含RAD16-I的空白对照溶液以相同的步骤制备。

2.2 动态光散射测定混悬液中粒子粒度分布 上述磁力搅拌下制备的RAD16-I-PY混悬液于测定前剧烈振摇，取适量采用动态光散射激光粒度仪测定混悬液中粒子的粒度分布。

2.3 EPC脂质体的制备 在1 L圆底烧瓶中加入约50 mL的EPC氯仿溶液(20 mg/mL)，旋转蒸发仪上蒸发除去氯仿，在烧瓶底部形成一层薄膜，加入310 mL pH7.4的25 mMTris/乙酸缓冲液(含0.2 mM EDTA)，充分振摇后的混合液于超声波清洗仪中在氮气通入、0 ℃冰水浴上超声30 min，其后于4 ℃、7000 rpm 离心1 h，收集上清液4 ℃储存。

2.4 稳态荧光测定 以日立F-4500荧光计测定不同状态下芘的稳态荧光。所有混悬液和溶液均分别置于4 mL比色皿中，通过直角光路测定其荧光光谱，而固体粉末芘晶体的荧光光谱则采用固体支架测定。所有样品的发射光谱均在336 nm激发，在350 nm到650 nm测定；激发光谱分别在373 nm和470 nm发射波长测定。

3 结果

3.1 RAD16-I对芘的稳定作用 芘的水中溶解度约为6.0×10-7M[8]；在有RAD16-I存在的条件下, 芘与水在磁力搅拌下形成相对稳定的混悬液，初步表明自组装短肽RAD16-I在水溶液中对芘(约5×10-3M)有一定的稳定作用。不加肽的对照样品中芘漂浮于液面或沉在底部，溶液在搅拌过程基本保持透明(见图1)。动态光散射测定结果表明，自组装短肽水溶液与芘形成的混悬液中粒子的粒度范围在500～5000 nm，平均粒度为1800 nm(见图2)，表明芘在水溶液中RAD16-I的作用下形成微晶形式存在的胶体混悬液。

A：芘晶体在水中;B:芘晶体在RAD16-I水溶液中形成胶体混悬液。

3.2 芘在不同存在形式下的荧光发射光谱 图3分别表示不同状态下芘的稳态荧光发射光谱。图3A、B所示的固体粉末芘的发射光谱与RAD-PY溶液中芘的发射光谱几乎相同，都表现为峰位在475 nm左右的强荧光激基二聚体谱带，而单体发射谱带几乎不可见。这进一步表明，芘在与自组装短肽形成的混悬液中是以微晶体形式存在。而图3C、D所示的芘在EPC脂质体中和在混合液中的发射光谱也非常相似。在EPC脂质体溶液中和在混合液中芘的荧光发射光谱的I1/I3值都约等于1.1，这和已经报道的脂质体中芘的I1/I3值一致[9]，提示芘在混悬液与脂质体的混合液中的存在形式与其在EPC脂质体中相同，初步表明被水溶液中RAD16-I所稳定的微晶形式的芘能够释放到模拟细胞的脂质体的脂双层膜中。

图2 RAD16-I-PY混悬液中粒子粒度分布

A:固体芘晶体;B:RAD-PY混悬液;C:含芘的脂质体;D：RAD-PY混悬液与脂质体的混合液；激发波长336 nm。

3.3 芘在不同存在形式下的荧光激发光谱 图4分别表示固体粉末、混悬液、EPC脂质体溶液和混悬液与脂质体的混合液中芘的稳态荧光激发光谱。发射波长373 nm测得的激发光谱代表芘单体，而发射波长470 nm测得的激发光谱代表激基二聚体。如图4 A和B所示，固体粉末中芘的激发光谱与RAD-PY混悬液中芘的激发光谱相似：在发射波长470 nm条件下测得的激发光谱比发射波长373 nm下测得的激发光谱红移了约38 nm。这表明固体粉末和RAD-PY混悬液中的芘的激基二聚体均主要为“静态激基二聚体”，这从另一角度表明芘在RAD-PY混悬液中与在固体粉末中的存在形式相同，即在在RAD-PY混悬液中芘以晶体状态存在。而图4 C和D表明，在含芘的EPC脂质体溶液和脂质体溶液与混悬液的混合液中芘的激发光谱相似，芘的激基二聚体主要为“动态态激基二聚体”，即2种溶液中均有大量分子形式的芘存在。这进一步印证了比较发射光谱所得的推测：芘以微晶形式被RAD16-I稳定在水性混悬液中，并能以分子形式向卵磷脂脂质体膜释放。

A：固体芘晶体；B：RAD-PY混悬液；C：含芘的脂质体；D： RAD-PY混悬液与脂质体的混合液；实线、虚线图谱分别在发射波长373 nm、470 nm测得。

4 讨论

选择芘为模型疏水性化合物，是由于其在水中的溶解度极低，而且具有独特的可作为介质极性探针的荧光特性。芘在水溶液中RAD16-I的作用下形成微晶形式存在的胶体混悬液。可能是由于RAD16-I具有稳定的β折叠的二级结构，其疏水面能够吸附到芘的微晶上面，而亲水面朝外使得较大量的芘能在水中相对稳定地存在。

疏水性化合物必须首先通过细胞膜，才能到达细胞的其他疏水部位。因为细胞膜的结构为脂质双分子层，为了相对近似地模拟药物载体向目标细胞传送水难溶性药物的过程，本文参考文献[5]的方法以脂质体模拟细胞，通过比较芘在固体粉末、混悬液、EPC脂质体中和混悬液与脂质体的混合液中的荧光光谱，考察疏水性化合物从自组装短肽RAD16-I包裹中释放的可能性。

芘通常是作为一种研究介质极性的荧光探针，其稳态荧光发射光谱I1/I3值(荧光发射第一谱带与第三谱带强度之比)与介质极性有较好的相关性。I1/I3在水中为1.8左右，通常随溶液极性下降而减小。由于芘的激发单线态可以和基态芘分子碰撞形成激基二聚体，此二聚体在470～480 nm处有较强的荧光，常用来测定蛋白质溶液的构象变化[9]。芘的这种独特的荧光特征在本文中用以表征芘在不同介质中的存在形式以及芘从与自组装短肽形成的混悬液释放到脂质体的可能性。芘的激基二聚体可以简单地分为两种，由基态二聚体直接激发所形成通常可称为“静态激基二聚体”，其激发光谱与单体激发光谱相比有一定波长的红移；而来自于激发态芘单体与基态芘单体的自由碰撞所形成通常可称为“动态激基二聚体”，其激发光谱与单体激发光谱的峰位重合[11-12]。对不同存在形式下芘的稳态荧光发射光谱和激发光谱的分析比较可以得出如下推论：在机械搅拌下，水溶液中的自组装短肽RAD16-I对水难溶性的芘有分散作用，并能吸附到芘的微晶之上而形成相对稳定的混悬液，芘在此混悬液中以被RAD16-I包裹的微晶形式存在；当该混悬液与EPC脂质体溶液混合时，被RAD16-I包裹的芘微晶能够以分子形式扩散进入EPC脂质体的脂质双分子膜中。

本文的研究表明，RAD16-I发挥了胶体稳定剂的作用，其自组装形成的疏水面能够吸附到芘的微晶上面，而亲水面则朝外使得较大量的芘能在水中相对稳定地存在。当和EPC脂质体混合时, 芘能从短肽包裹的芘的微晶体转移到脂质体膜。这种稳定、包裹和释放能力加上离子互补型自组装短肽相对优良的生物相容性，使其具备作为疏水性化合物和水难溶性药物载体的潜力。

在药物开发研究中，选择适合药物特点的载体材料已经成为近年来国内外的主要研究热点之一[13]。尽管本实验表明了离子互补型自组装短肽具有作为疏水性化合物载体的潜力。但离子互补性自组装短肽开发为现实可用的水难溶性药物载体还有许多问题需要解决。一方面需要深入研究自组装短肽与疏水性化合物或难溶性药物之间的相互作用，另一方面需要设计开发新的短肽、并进一步降低短肽的合成成本或考虑自组装短肽与其它材料的复合，这些都是自组装短肽能够真正被开发为可用药物载体材料的必然要求。

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[收稿2014-11-14;修回2014-12-20]

(编辑：王福军)

Effects of self-assembling peptide RAD16-I on stabilizing hydrophobic compounds in water

TangFushan1,YuanLingyan2,GaoDongfang1,SongHong3

(1.Department of Clinical Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2.Department of Basic Nursity, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 3.Department of Microbiology, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To investigate effects of self-assembling peptide RAD16-I on stabilizing hydrophobic compounds in water.Methods Colloidal suspensions of model hydrophobic compound, pyrene, were prepared with the RAD16-I peptide in water under magnetic stirring; the particle size distribution in the suspension was characterized through dynamic light scattering, and the existence form of pyrene in the colloidal suspensions was characterized and the possibility of pyrene being transferred from the suspensions into membranes of phosphatidylcholine liposomes was detected through fluorescence spectrophotometry. Results Relatively stable suspension of pyrene, with average diameter about 1800 nm, can be formed with RAD16-I in water under magnetic stirring and took a form of microcrystal in the suspension, suggested by fluorescence emission and excitation spectra; when the suspension was mixed with phosphatidylcholine liposomes, pyrene microcrystals in the suspensions can be molecularly transferred into membranes of the liposomes. Conclusion The self-assembling peptide RAD16-I can stabilize pyrene in water, thus has the potential as carriers for hydrophobic compounds or drugs.

self-assembling peptide; RAD16-I; hydrophobic compound; pyrene;fluorescence spectrophotometry

国家自然科学基金资助项目(NO: 31460246)；贵州省科技厅、遵义医学院、遵义市科技局联合基金计划项目(NO:黔科合LH字[2014]7564)；遵义医学院博士科研启动基金资助项目(NO: F-583)。

O641.2

A

1000-2715(2015)01-0092-05