SPE-GC/MS法分析鱼塘水中的5种农药

蔺大伟 ，张 艳 ，孙红雷 ，李文海 ，邵 凯

（1．泰安市公安局刑警支队刑事科学技术研究所，山东 泰安 271000；2.泰安市公安局泰山区分局刑事科学技术室，山东 泰安 271000）

近些年来，我国农村地区水产养殖业发展迅速，同时，随着社会不稳定因素增加，致使鱼塘投毒案件激增。鱼塘投毒不仅对养殖户危害重大，而且对周围环境、村民及牲畜存在很大的潜在危险，对生态系统造成长期影响[1]。该类案件最大的特点是使用毒物的随机性大、地域性强、鱼塘水中毒物含量低，其前处理方法多采用液-液萃取[2]和固相萃取（solid phase extraction，SPE）[3]。SPE现已成为毒物学分析中被广泛采用的样品前处理技术[4-5]。谢伟宏等[3]用DIKMA ProElutTMC18固相萃取柱提取鱼塘水中6种拟除虫菊酯类农药，利用气相色谱-电子捕获检测器（gas chromatography-electron capture detector，GC-ECD）进行检测，回收率在65.4%～88.4%。

本研究利用SPE联合气相色谱-质谱联用仪（GC/MS）检测克百威、硫丹、甲基对硫磷、莠去津和马拉硫磷等本地区鱼塘投毒案件中常见的5种有机磷类、氨基甲酸酯类和除草剂类农药。分别考察3种萃取柱的提取回收率，并对不同洗脱剂和洗脱体积的洗脱效果进行比较，建立同时提取鱼塘水中5种农药的固相萃取方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

PE Clarus 500 GC/MS型气相色谱-质谱联用仪、Elite-5MS毛细管气相色谱柱（30m×0.25mm，0.25μm）（美国珀金埃尔默公司），12管固相萃取装置（美国GC Science公司），氮吹仪（美国PIERCE公司），精密移液器［大龙医疗设备（上海）有限公司］，Oasis HLB cartridge固相萃取柱（6mL/500mg，美国 Waters公司），Bond Elut C18固相萃取柱（6 mL/500 mg，美国 Varian公司），SampliQ C18固相萃取柱（6 mL/500 mg，美国Agilent公司）。

1.2 试剂

克百威、硫丹、甲基对硫磷、莠去津、马拉硫磷标准品（99%高纯）均购自国家标准物质研究中心；乙醇为色谱纯，购自美国Mallinckrodt Baker公司；甲醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、苯均为分析纯，购自天津永大化学试剂开发中心。鱼塘水取自泰山区周边未被污染的鱼塘。

1.3 工作液的制备

质量浓度50 μg/mL的单一标准工作液的配制：准确称取5mg各标准品分别置于100mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，4℃下保存3个月。

1.4 试样的配制

分别取50 μg/mL的单一标准工作液各10 mL，加入500mL容量瓶中，用鱼塘水定容至刻度摇匀，配成1μg/mL的鱼塘水试样，待用。

1.5 方法

将100mL鱼塘水试样通过远端放置脱脂棉的分液漏斗，用于过滤鱼塘水中的杂质及浮游物，以免阻塞固相萃取柱。

SPE处理过程：用5 mL甲醇以1 mL/min的流速淋洗活化萃取柱，再用3mL去离子水以1mL/min的流速过柱，使萃取柱处于水溶性状态；将过滤干净的100 mL鱼塘水试样以1 mL/min的流速通过萃取柱；用5mL去离子水以1mL/min的流速过柱洗去杂质；最后用3 mL洗脱剂以0.5 mL/min的流速洗脱，收集洗脱液于试管中。氮吹仪浓缩至近干，加1mL乙醇定容，供GC/MS检测。

1.6 GC/MS条件

1.6.1 色谱条件

Elite-5MS毛细管气相色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；载气为氦气，纯度 99.999%，流速 1mL/min；初始柱温 80℃，以 10℃/min升温至 280℃，保持10 min；进样器温度250℃，不分流进样，进样体积1μL。

1.6.2 质谱条件

电离模式：EI，能量70eV，离子源温度200℃，延迟扫描4 min，传输线温度250℃，电子倍增器电压500V；质量扫描范围：40～500amu。定量离子（m/z）：克百威为164、硫丹为195，甲基对硫磷为109、莠去津为200、马拉硫磷为73。

2 结果与讨论

2.1 SPE条件优化

2.1.1 固相萃取柱的选择

本实验考察了 Oasis HLB cartridge、Bond Elut C18和SampliQ C18固相萃取柱的提取效果，采用空白鱼塘水加混合标准溶液的方式进行提取回收率实验，每种固相萃取柱平行测定3次。5种农药的保留时间（tR）分别为克百威 16.09 min、硫丹 19.09 min，甲基对硫磷17.27min、莠去津15.42min、马拉硫磷17.59min。由表1可见，Bond Elut C18固相萃取柱（6mL/500mg）对鱼塘水中除草剂莠去津及甲基对硫磷的提取回收率高于其他两种小柱，SampliQ C18固相萃取柱对鱼塘水中硫丹的提取回收率低于其他两种小柱，3种固相萃取柱对鱼塘水中克百威、马拉硫磷的提取回收率基本相同。因此本实验采用Bond Elut C18固相萃取柱（6mL/500mg）。

表1 不同固相萃取柱对试样提取回收率的比较（n=3，%）

2.1.2 洗脱剂的选择

本实验选取苯、二氯甲烷、乙酸乙酯和V（二氯甲烷）∶V（正己烷）=1∶1 作为洗脱剂进行洗脱实验，每一种洗脱剂平行进行3次测定。由表2可见，用苯作为洗脱剂时，对5种农药组分洗脱效果较好，提取回收率均高于60%；二氯甲烷、乙酸乙酯作为克百威、甲基对硫磷、莠去津和马拉硫磷的洗脱剂，提取回收率也较为满意，只是洗脱硫丹的提取回收率较低，而混合洗脱剂 V（二氯甲烷）∶V（正己烷）=1∶1 的提取回收率不理想，所以本试验选择苯作为洗脱溶剂。

表2 使用Bond Elut C18固相萃取柱不同洗脱剂对试样提取回收率的比较 （n=3，%）

2.1.3 洗脱剂体积优化的选择

本实验选用3、4、6 mL剂量的苯进行洗脱实验，考察不同剂量洗脱剂洗脱后的提取回收率，每个洗脱剂量平行进行3次测定。由表3可知，洗脱剂用量为3、4mL时提取回收率均较为满意，使用6mL苯洗脱时，在挥干定容过程中用时长，农药组分损失也较多，影响实验提取回收率。因此，为了最大程度节约时间，试验选用3mL洗脱剂进行洗脱。

表3 不同洗脱剂体积（苯）对试样提取回收率的比较（n=3，%）

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系和检出限

取100 mL经测定不含农药的鱼塘水样，加入农药标准液，配制含 1、5、10、25、50μg/mL 混合试样，使用 Bond Elut C18固相萃取柱（6 mL/500 mg）萃取，按1.5节方法提取，3 mL苯洗脱，经浓缩定容后利用GC/MS法分析。5种农药质量浓度的线性范围为1～50μg/mL，以农药的峰面积（y）对其质量浓度（x）进行线性回归。以3倍信噪比（S/N）所对应的质量浓度（μg/L）为检出限（表 4）。

表4 5种农药的标准曲线和检出限

2.2.2 准确度和精密度

取500mL鱼塘水，配制成含5μg/mL的混合试样作加标回收试验，每个加标样品做3次单独测定，使用Bond Elut C18固相萃取柱（6mL/500mg），按 1.5 节方法进行萃取，3mL苯作为洗脱剂，浓缩定容后，取1μL进样进行GC/MS分析。以提取回收率表示准确度，以相对标准偏差（RSD）表示精密度。5种农药的提取回收率在61.49%～102.48%，方法准确度较高，RSD均小于3.01%（表5），表明本方法的测定结果准确，精密度和可靠性较好。

表5 5种农药的提取回收率和相对标准偏差（n=3，%）

2.3 方法应用

2013年7月1日下午，本市某村徐某发现自己鱼塘内的鱼开始死亡。鉴定部门提取死鱼较多水域的待检水样及对照水样，应用本研究方法进行分析检测，成功从待检水样中检出硫丹（tR=19.12 min）成分（图1），为案件的进一步侦查提供了方向。

图1 鱼塘水中硫丹（箭头）总离子流图