15个基因座复合扩增体系的建立及新疆维吾尔族遗传多态性

桂 娟 ，刘海渤 ，廖琴香 ，徐 旭 ，鲁 涤 ，袁 丽

（1.司法文明协同创新中心，北京 100088；2.中国政法大学 证据科学教育部重点实验室，北京 100088；3.兵团公安局物证鉴定中心，新疆 乌鲁木齐 830000）

短串联重复序列（STR）是以2～6 bp核心序列为重复单位的基因片段结构，其长度一般在100～500bp，具有多态性好、易于扩增、易自动化检测、快捷等优点，在群体遗传学研究、疾病相关性研究、法医学个体识别和亲权鉴定中具有重要的应用价值[1-2]。本研究应用多重聚合酶链式反应（PCR）和五色荧光自动化检测技术建立15个基因座荧光复合扩增体系，并对新疆维吾尔族群体进行遗传多态性分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本

采集新疆维吾尔族无关健康个体血样299份（均经知情同意）。种属特异性研究选取猩猩、蜘蛛猴、黑猩猩、黑白猕猴、大猩猩、黑冠猕猴、雪貂等DNA（由公安部物证鉴定中心提供），以及兔、羊、猪、犬、猫、鸭、鸡、牛、鲫鱼等常见动物肌肉样本。同一性研究采集志愿者的血液、口腔拭子、带毛囊的毛发样本。系统灵敏度研究采用9947A样本。

1.1.2 仪器和试剂

9700型PCR扩增仪（美国AB公司），3130遗传分析仪（美国AB公司），-86℃超低温冰箱（美国Thermo公司），超纯水仪（美国Millpore公司）。

PCR反应缓冲液、ILS500内标（公安部物证鉴定中心），去离子甲酰胺、POP-4胶（美国AB公司），Chelex-100（美国 Bio-RAD 公司），0.5 ng/μL 9947A（美国Promega公司），引物委托上海生工生物有限公司合成，等位基因测序由北京诺赛生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 基因座的筛选

经文献筛选及前期遗传学调查，确定13个常染色体 STR 基因座（D4S2366、D9S925、D3S1744、D11S2368、D15S659、D17S1290、D7S3048、GATA198B05、D14S608、D20S470、D18S535、D19S253、D10S1435）、1 个 X 染色体基因座DXS7132和1个性别基因座Amelogenin。

1.2.2 复合扩增体系的建立

根据STR基因座等位基因数目和核心区域大小安排基因座位置，利用Primer 3软件重新设计引物，并用 BLAST检测，分别采用6-FAM、HEX、TAMRA、ROX荧光素标记引物前导链5′端，内标使用ILS500，构建五色荧光复合扩增体系。观察复合体系扩增情况，如出现扩增效率不高、非特异性峰、基因座之间距离在10bp以下者，重新设计基因座引物。

1.2.3 直接扩增法检测及引物优化

在离心管中配置10 μL直接PCR扩增体系，包含：2×MasterMix缓冲液（内含 Taq 酶） 5μL，引物 1～5μL，用去离子水补足至10μL。用打孔直径0.5mm或1.0mm的打孔器打孔，将样本FTA血卡分别加入离心管，每次电泳设置9947A阳性对照。

PCR 热循环参数：72℃ 20min，95℃ 11min；94℃30s，59℃ 2min，72℃ 1min，27 个循环；60℃ 60min，25℃保存。在9700型扩增仪上进行PCR扩增。

优化各基因座引物浓度，最终实现复合扩增体系中全部基因座的同步扩增和各基因座之间的等位基因峰值基本平衡。

1.2.4 复合扩增体系的可行性研究

同一性及稳定性检测：采集志愿者的血液、口腔拭子、带毛囊的毛发。配置PCR反应体系，室温（15～18℃）分别放置 0、12、24、48、72h 进行 PCR 反应。

系统灵敏度检测：在10μL扩增体系中分别加入0.8、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.08 ng 的 9947A，测试体系的灵敏度。

种属特异性检测：对灵长类动物及常见动物的样本进行种属特异性分析，样本DNA量为0.4～0.8ng。

1.2.5 等位基因测序及命名

对基因座的等位基因测序，按照重复序列重复次数进行命名[3]。

1.2.6 群体遗传学调查

利用PowerStats v12软件（美国Promega公司）进行统计学分析，得到13个常染色体STR基因座在新疆维吾尔族群体中的等位基因频率、多态信息含量（PIC）、观察杂合度（Ho）、个体识别率（DP）、非父排除率（PE）。利用Genepop v4.2软件对基因座的基因型频率分布进行Hardy-Weinberg平衡检验、期望杂合度（He）、连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）检验[4]；对 D9S925、D11S2368、D15S659、D17S1290、D7S3048、GATA198B05、D14S608和D20S470等8个基因座在新疆维吾尔族人群与西藏藏族[5]、岫岩满族[6]和广州汉族[7]之间比对，进行不同群体间的差异性检验。

2 结 果

2.1 直接扩增检测结果

在10μL直接扩增的PCR反应体系中，各基因座引物浓度优化结果为：2.5μmol/L各基因座引物在0.08～0.36μL。15个基因座均得到有效扩增，扩增片段长度在100～330bp，各基因座的等位基因峰均衡性好，且无明显非特异性峰（图1）。

图1 一个样本的15个基因座复合扩增体系分型图谱

2.2 复合扩增体系的可行性检测结果

同一志愿者的血液、口腔拭子、带毛囊的毛发各类型样品得到完整一致的分型；配制好的PCR反应体系室温（15～18℃）放置72h以内无差异；本体系灵敏度为0.3 ng；在种属特异性检验中，灵长类动物猩猩、大猩猩、黑猩猩可检出部分等位基因，而蜘蛛猴、黑白猕猴、黑冠猕猴、雪貂、兔、羊、猪、犬、猫、鸭、鸡、牛、鲫鱼均未检出特异性峰。

2.3 STR基因座等位基因测序结果

根据基因座等位基因的测序结果，按照标准命名法进行命名，各基因座的核心序列及遗传定位见表1。

在299名中国维吾尔族无关个体中，D4S2366、D9S925、D3S1744、D11S2368、D15S659、D17S1290、D7S3048、GATA198B05、D14S608、D20S470、D18S535、D19S253、D10S1435和DXS7132基因座在新疆维吾尔族人群中分别检出等位基因 7、11、9、11、11、13、13、13、11、14、8、9、9 和 8 个，利用 PowerStats v12 软件计算出14个STR基因座等位基因频率，结果见表2。

表1 新疆维吾尔族14个STR基因座遗传特征

表2 新疆维吾尔族14个STR基因座的等位基因频率 （n=299）

续表2

2.4 群体遗传学调查结果

2.4.1 群体遗传学参数

13个常染色体STR基因座基因型分布经统计学检验，所有基因座均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），PIC 在 0.6970～0.863 5，Ho 在 0.745 8～0.872 9，He在 0.741 1～0.877 7，DP 在 0.888 9～0.969 6，PE在0.502 6～0.740 5，结果见表3。13个STR基因座的累积非父排除率和累积个体识别率分别为0.999998和0.999999999999。

表3 新疆维吾尔族13个常染色体STR基因座的群体遗传学参数 （n=299）

2.4.2 连锁不平衡检验

经LD检验，13个常染色体STR基因座不存在连锁不平衡现象（P＞0.05）。

2.4.3 新疆维吾尔族与其他民族之间的比较

通过群体差异性检验，新疆维吾尔族8个基因座等位基因频率与西藏藏族、岫岩满族、广州汉族分别在6、7、8个基因座上差异具有统计学意义（P＜0.05，表 4）。

表4 新疆维吾尔族群体与其他民族比较结果（P值）

3 讨 论

目前，在个体识别和亲子鉴定案件中主要检测常染色体STR基因座，大多案件检测20个以内的STR基因座即可满足鉴定要求，但是一些疑难复杂的鉴定，如单亲、祖孙、同胞、叔侄等案件，往往需要检测更多的STR基因座。本研究建立的复合扩增体系包括15个基因座，常染色体STR基因座和DXS7132基因座均为四核苷酸重复序列。等位基因命名根据ISFH[3]在1997年提出的从5′方向阅读，以5′端第1个可能包含在重复序列中的核苷酸为准来命名STR基因座，并结合首先公开发表的优先命名原则。

本研究群体调查采用DNA直接扩增法（以下简称“直扩法”），将未经DNA提取或其他前处理步骤的样本直接加入到PCR反应体系中，以获得扩增产物。直扩法减少了检验步骤，降低了检验成本，提高了检验效率，在大量样本的检测中，特别是在数据库的建设中能发挥重要作用。本研究也验证了利用直扩法能得到比较平衡、稳定的图谱。

新疆维吾尔自治区地处中国西北，深居亚洲内陆，维吾尔族以信仰伊斯兰教为主，有自己的语言文字，较少同其他民族通婚，可能积累着本民族的祖系基因。本研究通过对新疆维吾尔族人群进行观察，发现13个常染色体STR基因座均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），PIC、He、PE、DP 分别在 0.697 0、0.741 1、0.5026和0.8889以上，属于高识别率基因座[8]，且影子峰低，利于分型。联合13个STR基因座的累积非父排除率达0.999998，累积个体识别率达0.999999999999。新疆维吾尔族与西藏藏族、岫岩满族、广州汉族在D9S925、D11S2368、D15S659、D17S1290、D7S3048、GATA198B05、D14S608、D20S470 基因座上进行群体比较，差异具有统计学意义。