2型糖尿病大鼠高同型半胱氨酸血症对阴茎海绵体内钙敏感受体的影响

秦文波 迟宝进 姜大力 何昊麟 陈大印 张 鹏 李加彬

(佳木斯大学附属第二医院泌尿外科，黑龙江 佳木斯 154002)

全球约有1亿多勃起功能障碍(ED)患者，在40～70岁的男性中，约有52%的男性有不同程度的ED〔1〕。糖尿病、心血管疾病、抑郁症等是勃起功能障碍的重要危险因素〔2～4〕，其发生机制十分复杂，目前尚未完全清楚，也缺少理想的治疗手段。因此，本实验主要探讨2型糖尿病(T2DM)大鼠阴茎海绵体钙敏感受体(CaSR)变化。

1 材料与方法

1.1 T2DM型ED动物模型的建立 选用雄性Wistar大鼠50只，体重150～200 g，动物及饲料由佳木斯大学动物室提供。经检测每只大鼠性功能均正常，适应性喂养1 w后，随机取10只为正常对照组，余40只给予高糖高脂饮食4 w后，禁食8 h，按25 mg/kg一次性尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)，复制T2DM动物模型，第4天割尾取血检测外周血血糖，血糖 ＞16.67 mmol/L，并出现多饮、多食、多尿，体重减轻即确定 DM模型复制成功。注射STZ4 w后，将T2DM大鼠分组放在玻璃罐中，然后在大鼠颈部皮下注射阿扑吗啡 80 μg/kg，观察60 min，在此期间记录阴茎有无勃起，阴茎无勃起大鼠为成功成模。将造模成功大鼠随机分成三组:T2DM模型组，胰岛素治疗组，叶酸治疗组。

1.2 ED实验 分别于4 w和8 w两个时间点进行ED实验，每只大鼠在颈项背部皮下注射阿扑吗啡100 μg/kg。每只注射后观察60 min，并予以记录阴茎有无勃起和有无打呵欠。龟头充血或阴茎体勃起成角大于90度为勃起1次。

1.3 血中总同型半胱氨酸含量(Hcy)测定 各组大鼠于16 w后，尾静脉采血，分离血浆，采用酶联免疫法测定血中 Hcy含量。

1.4 激光共聚焦检测(LSCM)阴茎海绵体CaSR的表达情况解剖显微镜下仔细分离大鼠阴茎，获得阴茎球海绵体平滑肌。常规制备石蜡切片(3 μm)，将玻片放入60℃烤箱中，烤干备用。将玻片烘干，抗原修复，滴加适当比例稀释的一抗，4℃冰箱过夜加上山羊抗兔FITC荧光二抗(稀释度1∶50)，加上PI做细胞核的荧光标记(稀释度1∶1000)。用甘油进行封片，在激光共聚焦显微镜下拍照，各组随机选取2个部位，用Image-Pro Plus 6.0软件测量积分光密度(IOD)值。

1.5 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行方差分析SNK-q检验，χ2及Fisher精确概率法。

2 结果

2.1 大鼠血清胰岛素、血浆Hcy浓度、阴茎勃起次数 与正常对照组相比，T2DM模型组大鼠血清胰岛素、血浆Hcy浓度明显升高(P＜0.05);T2DM模型组大鼠阴茎勃起次数明显减少(P＜0.05)。与T2DM模型组相比，胰岛素治疗组和叶酸治疗组大鼠血清胰岛素、血浆Hcy浓度明显降低(P＜0.05);治疗后二组大鼠阴茎勃起次数明显增加(P＜0.05)。见表1。

表1 大鼠血清胰岛素、血浆Hcy浓度、阴茎勃起次数比较(n=10，±s)

表1 大鼠血清胰岛素、血浆Hcy浓度、阴茎勃起次数比较(n=10，±s)

与正常对照组比较:1)P＜0.05，与T2DM模型组比较:2)P＜0.05

阴茎勃22.72±1.688.67±2.091.93±0.71 T2DM模型组 51.60±3.461)23.91±2.311) 0.17±0.111)胰岛素治疗组 24.94±1.112)18.05±0.482) 0.32±0.632)叶酸治疗组 23.48±1.622)17.69±1.272) 0.29±0.612)起次数正常对照组分组 胰岛素(mmol/L)Hcy(μmol/L)

2.2 大鼠阴茎海绵体平滑肌CaSR的表达 T2DM模型组和叶酸治疗组大鼠的海绵体平滑肌中 CaSR表达〔(51896±8643)和(4269±6937)〕与正常对照组〔(34524±4985)〕比较均明显增多(P＜0.05)，胰岛素治疗组(40636±9957)CaSR表达明显少于T2DM模型组(P＜0.05)，与叶酸治疗组相比差异无统计学意义(见图1)。

图1 各组大鼠阴茎海绵体CaSR表达

3 讨论

T2DM早期多无胰岛β细胞功能减损，因此患者血清胰岛素水平接近正常或偏高，但血中胰岛素不能有效地控制血糖水平，表现为糖耐量异常;患者常出现靶组织对胰岛素反应不敏感甚至出现胰岛素抵抗的临床状态;T2DM患者常伴有肥胖、高血压、血脂异常，这些因素恰是心血管疾病的高危因素。在实验中选用Wistar大鼠建立T2DM动物模型，先通过尾静脉注射STZ造成糖耐量异常，再喂以高热量饮食诱发动物肥胖，持续喂养10 w后检测血清胰岛素水平升高，这与人的T2DM理生理改变相类似。此方法与实验性糖尿病动物模型建立的相关研究一致〔5，6〕，在研究T2DM方面已经得到了广泛应用。

研究表明高蛋白，高糖饮食可以引起高Hcy血症。而高Hcy是心血管疾病的独立致病因素之一。Hcy能使细胞产生氧自由基具有细胞毒性作用，并可以诱导血管平滑肌细胞增生，使血管硬化，促使内皮小血栓形成。诱导巨噬细胞吞噬低密度脂蛋白，加重粥样硬化。而作为动脉系统终末部分的海绵体动脉同样也会受累，进而导致ED〔7〕，这就说明高Hcy对心血管的致病作用也是ED的致病因素之一。经过阿扑吗啡试验而证明模型组大鼠阴茎勃起次数明显减少。即血浆Hcy浓度增高，大鼠阴茎勃起功能下降。前期研究证明〔8〕，电镜显示睾丸精原细胞线粒体呈空泡样变，嵴结构模糊甚至消失，线粒体的这些改变使其正常供能受到破坏，从而使精子发生终止于精母细胞和精子细胞阶段，导致管腔内精子数量明显减少。附睾主细胞表面绒毛脱落，腔内精子数量减少及光镜下阴茎平滑肌细胞数量减少，纤维结缔组织密度增加均表明糖尿病时，睾丸、附睾及阴茎的病理改变可能是造成生精功能障碍及ED的原因。

本研究采用LSCM检测发现模型组CaSR蛋白表达明显增加，提示CaSR的表达增加参与了ED的发生。CaSR是G蛋白耦联受体的C家族成员。CaSR主要分布在参与钙稳态调节的甲状旁腺、肾肠道、骨组织和肾组织以及其他细胞(中枢和外周神经、肝脏、血细胞、胰腺β细胞等)，其功能主要是维持Ca2+和其他金属离子稳态，尚可调节细胞增殖、分化、离子通道开启、激素分泌等。CaSR的配体主要是细胞外 Ca2+，Mg2+、Gd3+、新霉素、精胺等多价阳离子亦是CaSR的激动剂。CaSR可通过激活MAPKs(包括p38 MAPK，JNK和ERK)-细胞色素C-Caspase-3通路及 Fas受体死亡通路，诱导细胞凋亡〔9，10〕。前期研究还表明，NO和CO系统与钙通道相关性在ED发生发展中的作用〔11～13〕，本研究发现CaSR在大鼠阴茎海绵体平滑肌有表达，且在T2DM大鼠，阴茎海绵体平滑肌CaSR的表达异常。

研究表明，ED时钙库操纵性阳离子通道和受体操纵性阳离子通道在阴茎动脉平滑肌表达上调，可能是ED的一个新机制〔14，15〕。鉴于CaSR普遍在机体各系统、器官、组织和细胞中有表达，而且CaSR引起细胞内钙升高的机制也是通过钙库操纵性钙通道(SOCC)和受体操纵性钙通道(ROCC)，因此，推测CaSR在阴茎平滑肌细胞有功能表达，并可能参与ED的发生。

综上，本研究首次证明了，大鼠阴茎海绵体平滑肌有CaSR表达，T2DM诱导的CaSR表达增加在T2DM血管病变中发挥重要的作用，这也可能是T2DM大鼠ED的原因之一，其机制与CaSR介导的Ca2+增加有关，具体作用机制和信号途径有待于进一步研究。

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