SBP2基因哺乳动物表达载体的构建及其初步表达分析

盛延良 江旭东 罗文哲 卢凤美 孟庆媛 朱贵明 (佳木斯大学司法鉴定中心，黑龙江 佳木斯 154007)

硒蛋白是一类含有硒代半胱氨酸(Sec)的特殊蛋白质。在抗氧化、抗肿瘤和调节免疫等方面都具有显著的作用〔1～3〕;另一方面，硒蛋白的生物合成非常特殊，因为硒代半胱氨酸的编码密码子(UGA)恰恰就是正常情况下的终止密码子，其解码需要一系列复杂的反式作用因子以及顺式作用元件的相互作用才得以完成，而这种翻译效率仍然较低〔4，5〕。因此，深入研究各种反式作用因子以及顺式作用元件的作用机制具有重要的意义。硒半胱氨酸插入序列结合蛋白(SBP)2是一个多功能蛋白，属于L7Ae家族，SBP2蛋白C端含有RNA结合基序和核糖体结合基序，是Sec插入序列(SECIS)特异性结合蛋白，能与目前检测到的所有Ⅰ型和Ⅱ型SECIS的G-A/A-G四联体碱基对形成的Kink-turn基序相结合〔6，7〕。为了深入研究SBP2在UGA解码中的作用以及提高硒蛋白的基因工程表达效率，本实验构建了SBP2基因的哺乳动物表达载体，然后转染哺乳动物293T细胞中进行初步表达分析，并考察该基因的超表达对硒蛋白P转录水平的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠杆菌株(DH5α)、293T细胞、质粒pcDNA3.1(+)和质粒pCMV-XL4-SBP2为本实验室保存。限制性内切酶、T4 DNA连接酶、RT-PCR试剂盒等均购于宝生物工程(大连)有限公司。质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒等均购于天根生化科技(北京)有限公司。细胞培养所用培养基、血清、培养皿等为 Hyclone产品。转染试剂LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品。

1.2 方法

1.2.1 SBP2基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+) 用EcoRI和XbaI双酶切将目的基因SBP2编码区(2565 bp)连同其3'非编码序列(约830 bp)从其保存质粒pCMV-XL4-SBP2中一起切割下来，同时载体pcDNA3.1(+)也进行同样的双酶切，酶切产物使用回收试剂盒回收后，再用DNA连接酶于16℃进行过夜连接，次日取连接产物转化感受态DH5α，利用质粒电泳、酶切及测序等方法筛选和鉴定重组质粒的阳性克隆，进而获得正确的表达载体pcDNA3.1-SBP2。

1.2.2 pcDNA3.1-SBP2转染293T细胞及其表达分析 在完成pcDNA3.1-SBP2质粒构建后，为了检验该表达质粒的有效性，采用脂质体瞬时转染的方法转染293T细胞，同时以带有绿色荧光蛋白基因的质粒pcDNA3.1-GFP(为本实验室自行构建)作为对照。为了考察硒对基因表达的影响，设置另一转染组，添加100 nmol/L无机硒进行实验。在转染后第3日收集细胞，提取总RNA，并以RT-PCR方法检测SBP2基因表达情况。PCR所用引物，正义:Sbg-s 5'AGGAACCACCAGTGACAGAGCAG 3'，反义:Sbg-a 5'GATTTCCTGTCTGTTCGCTTATGG 3'。PCR 扩增时退火温度为60℃，延伸45 s，循环30次。为了准确反映基因表达的变化，使用内参β-actin作为RT-PCR对照。

1.2.3 SBP2超表达对硒蛋白P表达的影响 为了考察SBP2超表达对硒蛋白P表达的影响，针对人硒蛋白P基因设计了一对检测引物，正义:Seg-s5'TGCGAGTAAAACTGAAGAAAGAAGG 3'，反义:Seg-a 5'CAGGATGAGTAGGAGCATTTGGTG 3'。PCR扩增时退火温度为58℃，延伸30 s，循环30次。同时使用内参β-actin作为RT-PCR对照，因为内参引物的退火温度与硒蛋白P检测引物的退火温度相近，所以将二者置于同一个PCR反应体系中进行扩增。

2 结果

2.1 成功构建SBP2基因的哺乳动物表达载体pcDNA3.1-SBP2 应用RT-PCR方法比较容易就可以将目的DNA片段扩增出来，如图1所示，目的条带大小符合预期。PCR产物经过纯化、双酶切并连入pcDNA3.1(+)载体，经过筛选和酶切鉴定获得阳性重组克隆。最终经测序鉴定证实目的基因并没有发生突变。见图1。

2.2 转染293细胞后SBP2T基因的表达及其对硒蛋白P的影响 将pcDNA3.1-SBP2表达质粒用于转染，转染时利用pcDNA3.1-GFP质粒进行对照，其绿色荧光可比较准确地反映转染效率。转染后第2天观察细胞，结果表明转染实验成功。转染后第3天收集细胞提取总RNA做RT-PCR实验，结果表明pcDNA3.1-SBP2质粒转染后293T细胞中SBP2基因实现了超表达。说明该表达质粒的构建是成功的。另外，培养的细胞添加硒后对SBP2基因的转录水平有明显的影响。SBP2对硒蛋白的转录水平有显著的影响，同时添加硒后，硒蛋白的转录显著增加。见图2～图4。

图1 pcDNA3.1-SBP2表达质粒的构建

图2 转染实验

图3 转染后RT-PCR实验结果

图4 硒蛋白P的RT-PCR实验结果

3 讨论

已有研究比较明确地证实了SBP2在硒蛋白的翻译中具有重要作用，但很多具体机制还有待进一步研究〔8〕。本研究考察了在转录水平，SBP2在体外培养的细胞中超表达后能否引起硒蛋白表达的提高。因为硒蛋白P在哺乳动物细胞发现的20多种硒蛋白中最具有代表性，除了类似于其他硒蛋白具有的抗氧化等功能外，还有转运硒的作用(硒蛋白P含有10个硒半胱氨酸，而其他硒蛋白均只含1个)〔9〕，所以利用硒蛋白P来考察硒蛋白的合成很合适。本实验结果发现，随着SBP2的超表达，硒蛋白P的转录水平也显著提高。当然这还不能确定硒蛋白的翻译是否受到影响。SBP2的超表达如何影响硒蛋白翻译水平还需要另作研究。另外，本研究再次证实了不添加硒的情况下，培养的细胞中硒蛋白P的转录水平是很低的，而在添加硒后，硒蛋白P的转录水平提高，这充分说明了其对硒蛋白表达调控的作用〔10〕。

1 Kryukov GV，Castellano S，Novoselov SV，et al.Characterization of mammalian Selenoproteomes〔J〕.Science，2003;300(5624):1439-43.

2 Méplan C，Hughes DJ，Pardini B，et al.Genetic variants in selenoprotein genes increase risk of colorectal cancer〔J〕.Carcinogenesis，2010;31(6):1074-9.

3 Heras I L，Palomo M，Madrid Y.Selenoproteins:the key factor in selenium essentiality.State of the art analytical techniques for selenoprotein studies〔J〕.Anal Bioanal Chem，2011;400(6):1717-27.

4 Small-Howard A，Morozova N，Stoytcheva Z，et al.Supramolecular complexes mediate selenocysteine incorporation in vivo〔J〕.Mol Cell Biol，2006;26(6):2337-46.

5 Jesus L A，Hoffmann PR，Michaud T，et al.Nuclear assembly of UGA decoding complexes on selenoprotein mRNAs:a mechanism for eluding nonsense-mediated decay〔J〕?Mol Cell Biol，2006;26(5):1795-805.

6 Sillers LC，Gonc N，Liao XH，et al.Selenoprotein deficiency syndrome caused by novel heterozygous mutations in the SBP2 gene〔J〕.Endocr Rev，2012;33:590.

7 Donovan J，Caban K，Copeland PR.Dissescting the role of SBP2 in selenocysteine incorporation〔J〕.FASEB J，2008;22:999-1000.

8 Chavatte L，Brown BA，Driscoll DM.Ribosomal protein L30 is a component of the UGA-selenocysteine recoding machinery in eukaryotes〔J〕.Nat Struct Mol Biol，2005;12(5):389-90.

9 Burk RF，Hill KE.Selenoprotein P-expression，functions，and roles in mammals〔J〕.Biochim Biophys Acta，2009;1790(11):1441-7.

10 Reszka E，Gromadzinska J，Stanczyk M，et al.Effect of selenium on expression of selenoproteins in mouse fibrosarcoma cells〔J〕.Biol Trace Elem Res，2005;104(2):165-72.