糟液循环对开放式餐厨垃圾乙醇发酵的影响及工艺改进

高 明，马鸿志，苏 伟，于 淼，田代幸宽，汪群慧，3（.北京科技大学环境工程系，北京 00083；.九州大学生物资源环境科学府，日本 福冈 8858；3.工业典型污染物资源化处理北京市重点实验室，北京00083）

糟液循环对开放式餐厨垃圾乙醇发酵的影响及工艺改进

高 明1，2，马鸿志1，3*，苏 伟1，于 淼1，田代幸宽2，汪群慧1，3（1.北京科技大学环境工程系，北京 100083；2.九州大学生物资源环境科学府，日本 福冈 8128581；3.工业典型污染物资源化处理北京市重点实验室，北京100083）

在前人研究的基础上对餐厨垃圾乙醇发酵糟液进行多次循环使用，以减少废液的排放量.重点考察了糟液循环对餐厨垃圾产乙醇的影响.结果表明:当未经处理的乙醇糟液在全回流条件下，对乙醇发酵产生明显抑制，全循环4次后乙醇产量由28.4g/L 降至2.56g/L.随着循环利用次数的增加，乳酸、SS、DS和盐分均产生积累，分别达5.45、64.7、99.5和12.3g/L.为提高糟液循环次数，本研究采用2/3的糟液回流和絮凝处理后全回流的方式，其糟液循环利用7次后，前者乙醇产生量维持在25.5～35.5g/L，而后者的乙醇产量在12.2～32.4g/L.糟液2/3回流循环效果要优于絮凝处理后全回流的方式，今后需考虑两者相结合进行糟液循环的方式.

餐厨垃圾；乙醇生产；开放式发酵；糟液循环

随着石化资源的日益枯竭，寻找替代性生物能源越来越受到人们的重视.乙醇是目前应用最为广泛的生物质液体燃料.当前我国发酵生产乙醇的原料以玉米、稻谷、小麦等粮食作物为主，生产成本较高，因此开发廉价生产原料一直是研究的热点.餐厨垃圾是指日常生活中食品加工、餐饮服务等活动中产生的食物残余和加工废料，随着经济发展及生活水平的提高其产量逐年激增［1］.由于餐厨垃圾含水率高，不宜焚烧，且易腐败发臭，是市政垃圾处理的难题［2-3］.利用餐厨垃圾作为原料发酵生产乙醇，既可为乙醇生产找到廉价原料，又可以减少垃圾对环境的污染，达到资源利用和环境保护的双重目的.

乙醇生产过程中会产生大量废糟液，且处理成本很高，有研究认为生成1t乙醇将产生10t左右的废糟液［4］.在传统乙醇工业生产中，糟液代替清水回流配料是糟液处理和综合应用的优化方案，糟液回流不仅节水、节能，还能减少环境污染.目前糟液回流循环发酵的方法在淀粉类粮食作物为原料的乙醇发酵中已被多次报道［5］.

餐厨垃圾自身含有大量微生物，发酵多在灭菌的条件下进行［6-7］.而不灭菌的开放式发酵不仅可以避免灭菌过程中的美拉德反应及糠醛类抑制物的生成，同时还具有低能耗、设备要求低和操作简单等优点［8］.目前餐厨垃圾开放式乳酸发酵已被报道［9］，而利用其进行乙醇发酵的试验均在灭菌的条件下进行［6］.如果开放式乙醇发酵可行，将为乙醇发酵糟液的回流循环利用提供了技术保障，且可实现操作简便、降低成本的目的.目前，没有研究将糟液回流利用的方法应用到开放式餐厨垃圾乙醇发酵过程中.

因此，本研究首先想证实餐厨垃圾开放式乙醇发酵的可行性，然后考察糟液多次循环对开放式餐厨垃圾乙醇发酵及垃圾减量化的影响.在此基础上进行优化，以实现节能减排和清洁生产的目的.

1 材料与方法

1.1 试验材料

餐厨垃圾取自北京科技大学学生食堂，经分拣除杂后，粉碎并保存于4℃冰箱中待用，垃圾平均含水率约为75%.

本研究采用耐高温酿酒高活性干酵母TH-AADY（湖北安琪酵母股份有限公司）作为乙醇发酵菌株.使用前，将菌粉加入2%蔗糖溶液中，35℃复水20min，降温至30℃活化1～1.5h.

1.2 餐厨垃圾的糖化与发酵方法

称取200g餐厨垃圾，加入清水，并调节固液比为1:1（W/V）.随后混合物料置于50℃水浴，按150U/g垃圾加入糖化酶（酶活 105U/g 北京奥博星生物技术责任有限公司），混匀，糖化过程持续90min，每10min搅拌一次使其充分糖化.

本研究采用开放式乙醇发酵，糖化后的餐厨垃圾不经灭菌直接接种0.1%（w/w）干酵母菌粉，置于35℃下发酵.

1.3 糟液回流循环发酵方法

对发酵后的物料进行蒸馏，将蒸馏后的餐厨垃圾酒糟4000r/min下离心15min，提取上层清夜，即为发酵废糟液.糟液循环发酵即利用发酵废糟液代替清水来调节餐厨垃圾培养基固液比进行糖化和乙醇发酵.

1.4 糟液絮凝处理方法

采用多种絮凝剂对回用的糟液进行了絮凝处理，最后选用效果较好， 且不会影响后续乙醇发酵的明胶溶液作为絮凝剂，其加入量达到明胶在糟液中的浓度为0.9g/L后，在温度30℃、搅拌速度500r/min的条件下絮凝30min.取絮凝后糟液，4000r/min条件下离心10min，提取上清液回用.

1.5 分析方法

餐厨垃圾发酵过程中的悬浮固体（SS）、溶解性固体（DS）含量采用重量法测定［10］.发酵样品经过预处理后，用于乙醇、还原糖、有机酸及含盐量的测定和分析.预处理条件为4000r/min下离心10min以提取上清液，并经0.45µm微孔滤膜过滤.乙醇浓度的测定使用生物传感分析仪SBA-40（山东省科学院生物研究所）.还原糖浓度测定采用DNS法［11］.有机酸浓度测定利用高效液相色谱仪LC-20A（日本岛津），紫外检测器SPD-20A，色谱柱Intersil ODS-SP C18（5µm，6.0×250mm）（日本岛津），利用超纯水作为流动相（磷酸调节pH值至2.5～3.0），流速0.8mL/min，进样量20µL，柱温30℃，检测器波长210nm.含盐量利用氯离子选择电极pClS-10（上海大普）进行测定.

2 结果与讨论

2.1 开放式餐厨垃圾乙醇发酵的可行性

曾有研究表明餐厨垃圾的干物质中糖类物质含量高达60%以上［12］，其中淀粉类含量最大，因此糖化后还原糖浓度较高，是极具潜力的微生物发酵底物.本试验中，餐厨垃圾经过预处理和糖化后，发酵初始还原糖浓度高达63.7g/L.餐厨垃圾培养基未经灭菌，在开放式条件下进行乙醇发酵，结果如图1所示.酵母菌表现出较高的产醇活性，还原糖几乎在36h内被全部消耗，尤其在24～36h间还原糖最大消耗速率达3.08g/（L·h）.同时，经过72h的发酵，乙醇浓度达31.8g/L，最大产醇速率为1.35g/（L·h） （24～36h）.本研究利用餐厨垃圾为发酵底物，由于其成分复杂，采用还原糖浓度来表征碳源含量，乙醇转化率用乙醇产量与还原糖消耗量来计算.因此，经72h开放式发酵，乙醇转化率为50.3%.本课题组先前研究表明，非开放式（餐厨垃圾预处理后进行灭菌）条件下接种酵母菌发酵，其最高乙醇浓度达32g/L［7］.相比之下，与本研究开放式条件下获得的乙醇浓度基本相近.本次试验用餐厨垃圾的平均含水率为75%，经核算乙醇转化率为0.254g/g干垃圾，达到了垃圾资源化的目的.

图1 餐厨垃圾开放式乙醇发酵过程中乙醇和还原糖浓度的变化Fig.1 Time course of ethanol and reducing sugar concentrations in open fermentation from kitchen garbage

餐厨垃圾本身含大量有机营养物质的同时，也含有大量的细菌.在开放式发酵条件下并不能将这些细菌杀死，因此本试验监测了作为细菌厌氧发酵产物的有机酸含量，其中甲酸、乙酸和乳酸的含量最多，其浓度变化如图2所示. 3种有机酸浓度均随发酵时间而逐渐升高，其中乳酸浓度增长明显且浓度最高达2.40g/L，而甲酸和乙酸最高浓度分别为0.253g/L和1.01g/L.整个发酵过程中pH值维持在3～4，并随着发酵进行而逐渐降低（图2）.本研究表明，乳酸是含量最高的有机酸，并且随着开放式乙醇发酵的进行不断产生.曾有研究利用PCR-DGGE技术分析餐厨垃圾中微生物群落构成，结果表明餐厨垃圾含有很多土著乳酸菌，如Lactobacillus sp.、Lactobacillus casei 和Lactobacillus plantarum等［13］.因此，本研究结果也符合这一结论.乳酸菌的存在不仅导致了乳酸的积累和较低的pH值，同时有研究表明乳酸菌可产生细菌素而对其他杂菌具有抑制作用［14］.向餐厨垃圾浆中添加0.5%～2.0%（V/V）的乳酸菌液，35℃下厌氧保存1～2d，可有效的抑制垃圾腐败，该研究同时表明:与厌氧保存、添加稀酸以及常规高温灭菌等抑菌方式相比，添加乳酸菌不仅抑菌效果良好，且不会发生高温灭菌过程中的美拉德反应，对后续的乙醇发酵十分有利［15］.一方面，较低的pH值也可有效的抑制杂菌的新陈代谢，本研究中酵母菌在pH值为3～4条件下仍具有较高的产醇活性.因此，综合以上分析，餐厨垃圾可以在开放式条件下进行乙醇发酵生产. ?

图2 餐厨垃圾开放式乙醇发酵过程中有机酸浓度和pH值的变化Fig.2 Time course of organic acid concentration and pH value in open fermentation from kitchen garbage

2.2 糟液全回流循环发酵对乙醇产量的影响

为最大限度地减少糟液的排放，本研究将糟液100%回流用于餐厨垃圾乙醇发酵中，试验结果如图3所示.其中，初次循环发酵中48.6g/L还原糖被消化，并生产28.4g/L乙醇，乙醇转化率为58.4%.而随着糟液循环利用次数的增加，乙醇产量和还原糖消耗量均逐渐降低.相应地，乙醇转化率在2次和 3次循环中分别降至38.6%和28.4%.当糟液循环利用到4次时，虽然乙醇产率为43.7%，但仅有5.87g/L还原糖被消耗，产醇量仅为2.56g/L.可见酵母菌产醇能力随着糟液循环次数的增加而大幅减低，糟液循环利用4次基本达到极限.目前，糟液循环利用法已经成功应用到各种原料的乙醇发酵中，如玉米粉［16］，谷物［17］，木薯粉［18］以及玉米麸［19］等，报道的糟液回用次数达8～22次.本研究以餐厨垃圾为发酵底物，且在开放式条件下进行，相比之下，发酵体系复杂，影响因素较多，因此糟液在未经过任何处理的条件下全回流利用次数仅为4次，远远低于其他原料.

图3 糟液全回流对餐厨垃圾开放式乙醇发酵的影响Fig.3 Effect of distillery wastewater full-recycling on open ethanol fermentation from kitchen garbage

2.3 全回流循环过程中糟液性质的变化特征

本试验中，餐厨垃圾糟液是垃圾经48h开放式乙醇发酵，并通过蒸馏提取其中乙醇后获得.由于蒸馏效率较高，糟液回用前的残留乙醇浓度极低（＜1.06g/L），不会产生积累.然而垃圾中的乳酸、盐分及未利用的有机营养物质等仍保留在糟液中，经初次发酵后，糟液中乳酸浓度为1.93g/L， pH值为3.97，含盐量为5.12g/L，SS和DS分别为25.7g/L和16.9g/L.因此，本研究针对以上糟液性质在全回流循环中的变化进行分析.

2.3.1 乳酸积累及pH值的变化 本研究考察了乳酸和pH值在糟液全回流循环发酵过程中的积累和变化情况（图4）.图中折线显示每次循环发酵前后乳酸和pH值的平均值，随着循环次数的增加，乳酸平均浓度逐渐增加，并在循环4次时达到5.45g/L，与初次循环相比，提高达3.84倍.另外，平均pH值也相应降低，至4次循环时降至3.43.因乳酸沸点较高（122℃），蒸馏乙醇时不能够将其除去，随着餐厨垃圾糟液的循环而逐渐积累到发酵体系中.其实在传统燃料乙醇工业生产过程中，由于不能够完全避免杂菌的存在，乳酸作为杂菌的代谢副产物而广泛存在于乙醇发酵体系中［20］.虽然在合成培养基纯培养条件下，乳酸对酵母菌的产醇抑制已经被多次报道［21-23］，其中Graves等以玉米浆为原料模拟工业乙醇发酵过程中，酵母菌可以耐受高达40g/L的乳酸，当pH＜5时亦可耐受30g/L乳酸，即利用生物质原料的乙醇发酵过程中，乳酸的影响并不明显.因此，本研究中乳酸浓度远没有达到文献报道的抑制浓度，所以乳酸的循环积累并不是乙醇产量降低的主要因素.

图4 循环过程中糟液的pH值及乳酸含量Fig.4 The pH value and lactic acid concentration in distillery wastewater during recycle process

2.3.2 SS和DS的积累 通过测定每次循环发酵液的SS和DS，发现除有机酸积累外SS和DS也随着糟液循环次数的增加发生积累（图5）.其中，发酵前DS含量由初次26.5g/L提高至99.5g/L；同时SS含量由42.0g/L提高至64.7g/L.相应地，发酵前的TS含量由68.5g/L积累到第4次时达164g/L.

本研究中废糟液代替清水循环发酵导致SS增加，在玉米麸乙醇发酵的研究中也被报道过，并且该研究发现高SS对乙醇发酵产生抑制［19］.此外，废糟液中未完全利用的残糖、溶解性蛋白、无机盐类及各种发酵副产物等均随着循环回用而积累在发酵液中，导致DS指标大幅提升.同时，发酵液粘度随着循环次数增加而明显提高，影响发酵体系中的传质效率而抑制发酵.因此，需要找到一种能够减少SS、DS等副产物的积累，再回流于乙醇发酵的方式.

图5 糟液全回流循环发酵时SS、DS的积累Fig.5 The accumulation of SS and DS with distillery wastewater full-recycling

2.3.3 含盐量的积累 由于人们的饮食习惯可知，餐厨垃圾含盐量必然较高，尤其是NaCl的含量，循环发酵必然将导致盐分的积累.如图6所示.糟液中初始的含盐量为5.12g/L，随着循环次数增加，垃圾中盐分不断积累到回用的糟液中，循环4次后，含盐量高达12.3g/L.先前研究表明，当含盐量超过10g/L时，酵母菌生长及乙醇发酵均被抑制［24］.全循环发酵进行到3次时，已经达到抑制浓度.因此糟液中盐分的积累将导致对发酵的影响.

2.4 糟液回流循环发酵方式的改进

目前，废糟液回流再利用导致产醇抑制已被广泛报道，部分研究认为废糟液中积累的发酵副产物，如甘油［16］、挥发性有机酸［18］以及无机盐类［19］等对酵母菌发酵均产生抑制，而且多种抑制物同时存在的条件下，会导致协同抑制效益进一步影响发酵［25］.本研究也发现乳酸、SS、DS和盐分随着循环次数的增加不断积累，导致乙醇产量大幅降低.为降低其抑制作用，本研究试图采用部分回流和絮凝处理的方法，对餐厨垃圾糟液进行循环发酵，以提高糟液利用次数，更大限度的节约水资源并达到清洁生产的目的.试验改进方案如图7所示.部分回流法是以降低糟液回流量的方法来减少抑制物积累，即糟液仅代替2/3的清水回流至发酵段；絮凝处理法是在糟液回用前，先用明胶絮凝去除糟液中部分抑制物，将絮凝后全部清液循环至发酵段.试验考察了两种改进模式下糟液循环7次过程中，经48h发酵后的乙醇产量和还原糖消耗量，如图8和图9所示.

图6 循环过程中糟液含盐量Fig.6 The salt concentration of distillery wastewater during recycle process

图7 糟液循环乙醇发酵的改进Fig.7 The technological enhancement of ethanol production with distillery wastewater recycling

在糟液的2/3回流时（见图8），还原糖消耗量在40.7～55.7g/L之间，糟液循环没有对发酵产生明显抑制作用，乙醇产量可保持在25.0g/L以上，最大产量达35.5g/L，乙醇转化率保持在45.0%以上.目前在玉米粉乙醇发酵研究中，未经处理的废糟液可代替75%的清水回流至发酵段，循环发酵次数可达22次［16］.本研究同样采用了部分糟液循环回流的方法，然而与玉米粉糟液相比，餐厨垃圾糟液的成分复杂，尤其盐分含量远高于玉米粉，因此本研究目前仅采用略低的2/3回流比例来改进糟液循环发酵系统，更适当的回流比例在今后的研究中需进一步优化.结果表明，2/3回流循环发酵方式，成功将糟液循环利用次数由4次提高到7次，虽然废液排放量较全回流发酵略高，但该方法的乙醇产量稳定，没有出现明显的抑制现象.

图8 2/3糟液回流条件下的乙醇生产Fig.8 Ethanol production with 2/3distillery wastewater partial-recycling

图9 絮凝糟液全回流条件下的乙醇生产Fig.9 Ethanol production with distillery wastewater full-recycling after flocculation

另一方面，絮凝后全回流组的还原糖消耗量在34.0～57.6g/L之间，最大乙醇产量为32.4g/L，至第7次循环时乙醇浓度为12.2g/L，比不絮凝且全回流循环第4次乙醇产量（2.56g/L）高3.77倍.这可能是由于絮凝不但可以减少SS在发酵体系中的积累，对溶解性有机物，如类蛋白物质也具有去除效果，降低循环糟液粘度，因此絮凝处理可在一定程度上提高全循环回流次数.然而餐厨垃圾成分过于复杂，絮凝对其发酵糟液的处理效果有限，乙醇转化率在4次循环大幅降低，第7次循环中降至36.0%.相比之下，玉米麸乙醇发酵中采用絮凝全回流方法，其循环次数可达10次且乙醇产量稳定［19］.故本研究需进一步优化糟液的回流处理.故本研究需进一步优化糟液的回流处理，如去除糟液中积累的抑制因子再回流，或将部分回流与絮凝后再回流相结合，以获得更高的糟液全循环次数，且最大限度地减少糟液的排放.

3 结论

3.1 餐厨垃圾乙醇发酵可以在开放式条件下进行，乙醇浓度达31.2g/L，乙醇转化率为0.254g/g干垃圾.此外，开放式乙醇发酵体系中乳酸随着发酵的进行而不断积累.

3.2 随着循环次数的增加，乙醇发酵被明显抑制，当循环利用4次时，乙醇产量由28.4g/L 降至2.56g/L，还原糖消耗量由48.6g/L 降至5.87g/L.

3.3 糟液中乳酸浓度、SS、DS及含盐量，随回用次数增加而逐渐积累，循环4次后分别达到了5.45、64.7 、99.5和12.3g/L.

3.4 采用2/3糟液回流和絮凝处理后全回流的方式，其糟液循环利用7次后，前者乙醇产生量维持在25.5～35.5g/L范围，而后者的乙醇产量在12.2～32.4 g/L范围.糟液2/3回流循环效果要优于絮凝处理后全回流的方式，今后需考虑两者相结合进行糟液循环的方式.

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Effects of distillery waste recycling on open ethanol fermentation from kitchen garbage and technological enhancement.

GAO Ming1，2， MA Hong-zhi1，3*， SU Wei1， YU Miao1， TASHIRO Yukihoro2， WANG Qun-hui1，3（1.Department of Environmental Engineering， University of Science and Technology Beijing， Beijing 100083， China；2.Graduate School of Bioresource and Bioenvironmental Sciences， Kyushu University， Fukuoka 8128581， Japan；3.Beijing Key Laboratory of Resource-oriented Treatment of Industrial Pollutants， Beijing 100083， China）. China Environmental Science， 2015，35（12）：3721～3727

Based on the previous studies， in order to reduce the distillery waste form ethanol fermentation， the distillery wastewater of ethanol production from kitchen garbage was recycled in this study. Particularly， the accumulation of the by-product during the fermentation and their effects were investigated. The results indicated that ethanol fermentation was inhibited obviously by full-recycling distillery wastewater without treatment. After 4times full-recycling， ethanol production was decreased from 28.4g/L to 2.56g/L. With the increasing recycling times， lactic acid， SS， DS and salinity were accumulated to 5.45， 64.7， 99.5 and 12.3g/L， respectively. In order to improve the recycle times， 2/3 partial-recycling mode and flocculation full-recycling mode were utilized. During 7times of distillery wastewater recycling， the ethanol productions maintained at the range of 25.5～35.5g/L for 2/3partial-recycling mode. While for flocculation full-recycling mode， the ethanol production maintained at the range of 12.2～32.4g/L. 2/3partial-recycling mode was superior to flocculation full-recycling mode. In future， the combination of the two recycling methods should be considered for further improving the distillery wastewater recycling system.

kitchen garbage；ethanol production；open fermentation；distillery wastewater recycle

X705

A

1000-6923（2015）12-3721-07

高 明（1984-），女，黑龙江哈尔滨人，博士后，主要从事生物质能源、环境生物技术的研究工作.发表论文10余篇.

2015-07-10

科技部国际科技合作专项资助（2013DFG92600）；国家自然科学基金（51378003）；北京高校青年英才计划

* 责任作者， 副教授， mahongzhi@ustb.edu.cn