冷冻技术对精子印记基因DNA 甲基化影响的研究

杨向祎，郭颖，曹小芳，贾艳飞，王晓尉，许剑锋，周芳，李鸿，梁小薇，卢文红＊，谷翊群＊

（1.北京协和医学院研究生院，北京 100730；2.国家卫生计生委男性生殖健康重点实验室，国家卫生计生委科学技术研究所，北京 100081）

表观遗传学是指在细胞核DNA 序列不发生改变的情况下，基因的表型发生稳定的可遗传的变化。例如DNA 甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑，这些修饰可以调节基因转录，在胚胎发育及个体成熟过程中起着重要的作用，还可以遗传给子代［1］。DNA甲基化是表观遗传学重要组成部分，指由DNA 甲基转移酶催化，以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶（C）转变为5-甲基胞嘧啶（5mC），即在CpG二核苷酸内将甲基基团转移到胞嘧啶的5位碳原子上。我国学者（2013）指出，精子而非卵子的DNA甲基化图谱可遗传给子代，子代选择性地继承父代而抛弃母代的DNA 甲基化图谱，并用于指导胚胎早期发育［2］。胚胎早期的DNA 甲基化异常可以导致男性不育及胎儿印记基因缺陷性疾病，如Beckwith-Wiedeman 综合征、Silver-Russell综合征，以及Angelman 综 合 征（Angelman syndrome，AS）／Prader-Willi 综 合 征 （Prader-Willi syndrome，PWS）。

精子低温冷冻保存技术已广泛应用于男性恶性肿瘤放化疗前、输精管绝育术前、辅助生殖技术中的自身精液或精子库捐精的精子保存［3］。虽然随着冷冻方法和冷冻保护剂的不断改良，使精子的存活率有了一定提高，但对精子活力、顶体反应发生率、形态学及授精能力仍然会造成了一些不可逆转的影响，而对表观遗传方面的损伤，至今仍然没有确切结论。国内外已经大量报道了辅助生殖技术会影响胚胎早期发育，甚至导致子代因表观遗传学改变所致的遗传缺陷，包括较高的生殖功能障碍、肿瘤及印记缺陷性疾病的发生风险等［4］。印记基因DNA 甲基化程度容易受外界环境如温度［5］、营养供给［6］、重金属［7］、早期环境刺激［8］和辐射［9］等的影响，从而发生甲基化程度的异常。冷冻技术是否会对精子印记基因DNA 甲基化程度产生影响鲜有报道，本研究旨在对此进行初步探讨。

材料与方法

一、样品采集与分组

1.精液样品收集：选取10例北京人类精子库符合捐精条件的正式志愿者为研究对象［10］。经国家卫生计生委科学技术研究所生殖医学伦理委员会批准及本人知情同意，所取精液全部用于本次实验。依据第5版《世界卫生组织人类精液检查与处理实验手册》［11］，志愿者禁欲3～5d，手淫法取精，精液完整收集于无菌干燥取精杯中，置37℃水浴中液化

0.5～1h。

2.精液分组：将完全液化的精液样品平均分为4组：A 组为0.5ml新鲜精液，作为对照；B组0.5ml新鲜精液加入0.5ml冷冻保护剂（自制），37 ℃水浴10min，不冷冻；C 组0.5 ml新鲜精液加入0.5ml冷冻保护剂，冷冻2d；D 组0.5 ml新鲜精液加0.5ml冷冻保护剂，冷冻两个月。

二、研究方法

1.精液冷冻复苏：本研究采用精子库常用的甘油-卵黄-柠檬酸盐冷冻保护剂（自制）以及液氮程控冷冻降温法对精子进行冷冻，复苏时采用37℃水浴快速复温5～10min［11］。

2.精子DNA 提取：精子DNA 的提取使用微量全基因组DNA 提取试剂盒（Omega，美国），每500μl样品加用配制的1 mol／L 的DTT 液20μl处理细胞膜。Nano Drop2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）检测DNA浓度与纯度（OD260／OD280），每个样品分装3管，标本置于-80℃保存。

3.亚硫酸氢盐处理：使用亚硫酸氢盐转化试剂盒（Qiagen，德国）处理精子DNA，其原理为DNA序列中CpG 岛内（5mCG）甲基化胞嘧啶（C）保持不变，未甲基化的胞嘧啶（C）都转化成尿嘧啶（U），经聚合酶链反应（PCR）扩增后，U 转化为胸腺胞嘧啶（T），分析PCR 产物中C／T 的含量（即C 的比值）可间接定量分析甲基化程度。

4.目的片段扩增：目的区域为H19 印记调控区（imprinting control regions，ICR）（GenBank accession no.AF087017，nucleotides 6 005～6 326），MEST ICR（GenBank accession no.Y10620，nucle-otides 609～898）［12］，PCR 用EX Taq HotStart试剂盒（TaKaRa，日 本），50μl反 应 体 系 为：0.25μl TaKaRa Ex Taq HS、5μl 10×Ex Taq Buffer、4μl dNT PMixture、5μl甲基化后DNA、正反向引物各2.5μl、灭菌蒸馏水30.75μl。反应置于冰上。PCR反应条件列于表1。

5.PCR 产物电泳及纯化回收：配置2%的琼脂糖凝胶，将PCR 产物电泳，通过凝胶成像分析系统，电泳结果见图1和图2。使用Easy Pure Quick Gel Extraction Kit琼脂糖凝胶回收试剂盒（全式金）对凝胶进行目的片段的回收。

表1 引物序列及半巢氏PCR 反应条件

图1 H19甲基化后DNA PCR 电泳图

图2 MEST 甲基化后DNA PCR 电泳图

6.TA 克隆测序：使用pEASY-T1Cloning Kit试剂盒（全式金），进行目的片段DNA 与质粒的连接。加连接产物于50μl感受态细胞中进行转化反应，取200μl转化产物菌液均匀涂于LB 平板上，37 ℃温箱培养过夜。挑取白色单克隆至10μl无菌水中，取1μl混合液于25μl PCR 体系，用M13通用引物进行菌液PCR 扩增来鉴定阳性克隆，将产物琼脂糖凝胶电泳。挑选含阳性单克隆菌落的菌液，加入500μl平衡至室温的液体LB培养基（含Kana抗生素，自制），200r／min，37 ℃培养3h左右。进行基因测序，测序结果用Chromas Lite 软件（Technelysium Pty Ltd，澳大利亚）打开，结果要求条带清晰，无套峰等情况。采用BIQ-analyzer甲基化分析软件（Max Planck Institution，德国）对测序结果进行序列分析及质控。

三、统计学分析

采用SPSS 19.0 统计软件，Bonferroni法进行多个样品率的两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、H19甲基化结果分析

1.H19ICR CpG 各位点甲基化状态分析：统计克隆数，H19总共测试了370个克隆，B、C、D 组的精子其H19ICR DNA 甲基化率以克隆数表示（甲基化克隆数占全部克隆数的百分比）时，与A 组相比，有降低趋势，但差异无统计学意义（P ＞0.05）。进一步统计CpG 岛数，目的片段含21 个CpG 岛，H19共测试了7 770个CpG 岛，H19ICR DNA 甲基化率以CpG 岛数表示（甲基化CpG 岛数占全部CpG 岛的百分比）时，分别与对照A 组的97.57%相比，差异亦无统计学意义（P＞0.05）。（图3、表2）。

2.冷冻保护剂对精子H19ICR 的DNA 甲基化程度的影响：H19ICR DNA 甲基化率分别以克隆数和CpG 岛数表示时，加冷冻保护剂的B组与未加冷冻保护剂的对照A 组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。因此，冷冻保护剂对精子H19ICR的DNA 甲基化程度未见影响。（表2）。

3.冷冻过程及冷冻时间对精子H19ICR 的DNA 甲基化程度的影响：H19ICR DNA 甲基化率分别以克隆数和CpG 岛数表示时，冷冻的C D 组与未冷冻的B 组相比，有降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；冷冻两个月的D 组与冷冻两天的C组相比，差异亦无统计学意义（P＞0.05）。因此，冷冻过程及冷冻时间长短对精子H19ICR 的DNA甲基化程度未见影响。（表2）。

二、MEST 甲基化结果分析

1.MEST ICR CpG 各位点甲基化状态分析：MEST 总 共 测 了295 个 克 隆，B、C、D 组 的 精 子MEST ICR DNA 甲基化率以克隆数表示时与对照A 组相比，有升高趋势，差异无统计学意义（P＞0.05）。目的片段含有31个CpG 岛，MEST 共测试了9 145个CpG 岛，MEST ICR DNA 甲基化率以CpG 岛数表示时，分别与对照A 组相比，差异亦无统计学意义（P＞0.05）。（表3、图4）。

图3 H19ICR CpG 各位点甲基化状态的点状图（BIQ 软件）

表2 四组H19ICR 甲基化状态比较［n（%）］

2.冷冻保护剂对精子MEST ICR 的DNA 甲基化程度的影响：MEST DNA 甲基化率分别以克隆数和CpG 岛数表示时，加冷冻保护剂的B组与未加冷冻保护剂的对照A 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。因此，冷冻保护剂对精子MEST ICR的DNA 甲基化程度未见影响。（表3）。

3.冷冻及冷冻时间长短对精子MEST ICR 的DNA 甲基化程度的影响：MEST ICR DNA 甲基化率分别以克隆数和CpG 岛数表示时，冷冻的C、D组与未冷冻的B 组相比，有降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；冷冻2个月的D 组与冷冻2d的C组相比，差异亦无统计学意义（P＞0.05）。因此，冷冻及冷冻时间长短对精子MEST ICR 的DNA 甲基化程度未见影响。（表3）。

图4 MEST ICR CpG 各位点甲基化状态的点状图（BIQ 软件）

表3 四组MEST ICR 甲基化状态比较［n（%）］

讨 论

印记基因是指同源基因中只选择性的表达一方亲本基因，另一方则不表达（最常见是由于DNA 甲基化），即呈现为差异性表达［13］。大多数印记基因都是成簇存在，通过不同的ICR 的顺式作用来调节其基因的表达或抑制。在许多基因启动子区，其CpG 二联核苷的概率高于正常，具有调控作用，被称为CpG 岛。CpG 岛的DNA 高甲基化会在空间上阻碍转录因子复合物与DNA 链结合，抑制基因的表达，这些区域低甲基化能促使基因表达。因此本实验通过选取印记基因的ICR 区，并对此区甲基化CpG 岛进行计数，即可代表整个基因的甲基化程度。

DNA 甲基化印记是周期性动态变化的，受精后胚胎细胞中从亲代遗传来的甲基化标记在去甲基化酶的作用下被擦除，胚胎植入子宫内膜前，新的甲基化标记又在基因组DNA 上重建。与普通基因组DNA 不同，印记基因ICR 区在继承父母双方各自的DNA 甲基化印记后，不经历受精后擦除、重建的过程，能稳定地遗传下去［14］。一旦受精前精子印记基因DNA 甲基化受外界环境如低温冷冻的刺激而发生异常，必然会影响到早期胚胎发育甚至子代身体健康。

父源印记基因H19 定位于人染色体11p15.5区，H19ICR 甲基化异常会导致男性不育、胎儿宫内生长受限［15］及子代印记缺陷性疾病的发生［16］。母源印记基因MEST 定位于人类染色体7q31-34，MEST ICR 甲基化异常会导致Silver-Russell综合症（SRS）［16］的发生。因此选择了这两个分别来自父源和母源的目的基因开展研究。

常用DNA 甲基化分析方法有：甲基化特异性PCR、亚硫酸盐的限制性内切酶法、亚硫酸盐氢测序PCR、变性高效液相色谱、焦磷酸测序法、飞行时间质谱平台、探针和芯片法等。本研究选择的是亚硫酸氢盐测序法虽然需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵，但可靠性及精确度很高，能明确目的片段中每个CpG 位点的甲基化状态。

本实验选取精子库入选的正式志愿者，无遗传性疾病家族史，无外伤及性功能障碍史，并进行了染色体核型分析，排除了少、弱精子症及染色体核型异常等因素的干扰。Collodel等［17］报道，冷冻保护剂会通过氧化应激对精子线粒体等微结构造成损伤。因此，本研究设置了未加保护剂的A 组和加保护剂的B组，本结果显示，保护剂的使用未对DNA 甲基化造成明显影响。Flores等［18］报道，冷冻对精子线粒体相关功能及蛋白的损伤是时间依赖性的。因此，本实验通过对冷冻2d的C 组及冷冻2个月D组的比较，随着冷冻时间延长，DNA 甲基化程度有增高趋势，但未见统计学差异。国外学者用焦磷酸测序技术检测冷冻4周的精子，检测了9个基因，其结果亦未见影响［19］，本文与其检测的结果一致。

本实验研究了冷冻技术、精液冷冻保护剂及冷冻时间对精子DNA 甲基化的影响，虽然统计学上显示这些因素都未对精子印记基因DNA 甲基化产生影响，但H19DNA 甲基化程度随着冷冻时间延长有降低趋势，MEST DNA 甲基化程度随冷冻时间延长有升高趋势，且3号志愿者MEST DNA 甲基化出现了异质性，说明冷冻技术可能对某些特定人群DNA 甲基化产生影响。受条件限制，本实验冷冻时间未达到临床保存所需的时间要求。在后续实验中，可通过扩大样品量、延长冷冻时间及增加候选基因个数，进一步研究与分析个体差异，为精子冷冻保护剂的改良、冷冻保存安全性评估提供参考依据。

致谢：感谢国家卫生计生委科学技术研究所出生缺陷干预实验室王启迪、曹小芳、郭昌龙等对本实验提供的技术支持。

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