家蚕肠道微生物的研究进展

郝志华 朱佳林 黄志君

（华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642）

家蚕作为我国重要的特种经济动物，在我国脱贫致富和国家出口创汇中发挥着特殊的作用。但家蚕容易感病和饲料效率低是影响养蚕业发展的主要问题，因此增强家蚕的抗逆性和抗病性，提升叶丝转化率，提高蚕茧的产量和质量一直是养蚕业努力的方向。近年来，微生态学得到较快的发展，肠道微生物在动物生长发育中所扮演的角色越发引起人们的重视。随着家蚕等昆虫的肠道微生物种类和功能的研究不断深入，发现肠道微生物在昆虫的营养吸收、抵御病原微生物和促进机体免疫功能等方面都发挥了重要作用。利用肠道益生菌作为饲料添加剂的研究也取得了较大进展，方丹等分离了鸡的肠道微生物并发现其中乳酸菌（lactobacillus）有抑制沙门杆菌（Salmonella）的效果，而且可促进鸡的生长。将益生菌体外培养制成微生态制剂添加到饲料中，能提高畜禽的免疫能力和消化能力，增产增收。顾金刚等研发了由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和黑曲霉（Aspergillus niger）组成的复合菌剂，能分别提高猪的日增重和鸡的生长速度。家蚕肠道微生物的研究也有了可喜的进展，周洪英等介绍了关于家蚕肠道微生物对增强蚕体体质和提高吐丝量等有良好的效果。除提高蚕茧产量外，以家蚕为模式动物研究肠道微生物的作用机理，对研究鳞翅目昆虫肠道微生物的功能和农作物害虫防控方面也将有重要的指导作用。

随着家蚕基因组计划的完成和生物技术研究的迅速发展，分子生物学技术的应用为肠道微生物的研究带来便利，也促进其快速的发展。家蚕肠道微生物的研究也得到不断的推进，本文就家蚕肠道微生物的类群、肠道微生物的功能和影响肠道微生物生存的因素等方面对其进行综述，展示家蚕乃至昆虫的肠道微生物的最新研究进展。

1 家蚕肠道微生物的类群

肠道作为食物消化吸收的器官也提供了肠道微生物生活的环境，食物的消化吸收除了需要肠道分泌的酶外，还需要肠道微生物分泌的酶类，肠道益生菌与动物达成了共生的关系，但除了益生菌外，肠道内还生活了其它寄生菌，所有这些菌构成肠道菌的多样性。家蚕肠道微生物的类群还随着蚕期、龄期和品种的不同，呈现出动态变化的多样性特点。孙雪奇等选取781×7532夏蚕为研究材料，分离并鉴定了该品种蚕肠道内微生物达16个属，包含葡萄球菌属（Staphylococcus）、微球菌属 （Micrococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）等好氧及部分兼厌氧菌群。李蒙英等研究发现家蚕肠道中的优势菌群为葡萄球菌属（Staphylococcus），其中阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）在家蚕品种苏5、苏6的肠道也是除葡萄球菌（Staphylococcus）外的优势菌群，在抗性较强的另外两种杂交品种中，优势菌群则包括了前两者和蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）。易发平等的关于家蚕肠道好氧微生物菌群的研究中针对蚕品种夏芳的肠道菌群再不同龄期和不同蚕期下的构成成分和优势菌群的变化进行了研究与分析，研究发现，春蚕的菌群数量要超过秋蚕，秋蚕肠道微生物菌群只有少量的微球菌科菌（Micrococcus）和芽孢杆菌属菌（Bacillus）等，春蚕则不仅含有微球菌科菌（Micrococcus）和芽孢杆菌属菌（Bacillus）还有大量的肠杆菌科菌（Enterobacteriaceae）。此外，春蚕在不同龄期中肠道微生物的优势菌群也表现出的差异，说明蚕体生理变化也影响其体内菌群构成。张剑飞等以K100和E23为实验材料对其肠道微生物分别分离鉴定，发现微球菌属（Micrococcus）和芽孢杆菌属（Bacillus）为优势菌群，且在不同龄期优势菌群的数量会发生变化，而所食用的桑叶表面附着的微生物也与其肠道的优势细菌所对应，说明饲料的微生物组成成分也会影响到肠道的微生物构成。田贞华等通过16s rDNA序列分析的方法来测定了家蚕肠道的14个不同微生物类群，说明了其家蚕肠道中微生物具有极丰富的生物多样性。

对家蚕肠道微生物的多样性与构成变化的研究所取得的进展，揭示了家蚕肠道微生物可因为品种、食物、季节和发育阶段而变化，家蚕肠道微生物丰富多样性也为研究家蚕肠道微生物与蚕体的互作提供了新的思路。

2 家蚕肠道微生物的功能

研究和了解家蚕肠道微生物种群及其对蚕体的影响和作用，再优化和改变肠道内的优势菌群，可达到增强家蚕体质和提高产量的目的。

近年来，对家蚕肠道微生物参与肠道营养消化吸收的酶学基础与功能进行了深入的研究，并取得了一定的成绩。高绘菊等以镇·珠X春·蕾为实验材料，从其肠道中分离了30种菌株，其中9种可以分泌蛋白酶，7种可以分泌脂肪酶，7种可以分泌纤维素酶，8种可以分泌淀粉酶。王在贵等从皓月和951等家蚕品种中分离并鉴定了家蚕肠道产蛋白酶菌株，利用16s rDNA分析法结合菌落形态特征观察判断之后，与GenBank的基因序列比对，发现其属于不动杆菌属（Acinetobacter）。杨文静利用大造蚕品种分离并通过分子生物学的方法鉴定了2株其肠道内产α-淀粉酶的菌株属蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）。冯伟利用桑叶和柘叶饲养家蚕后分别分离其肠道中的能产脂肪酶的菌株，发现不同饲料条件下的优势菌群有较大差异，桑叶饲养的家蚕肠道内含有的产脂肪酶菌群要远丰富于柘叶饲养的家蚕，桑叶喂食的家蚕肠道中分离出10种优势菌群，其中属短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）产酶能力较强。马如箭从家蚕肠道中筛选出12种产纤维素酶的菌株，并经过镜检和18s rRNA序列分析鉴定其为毛霉属（Mucor）真菌。丰富的菌群通过分泌各种消化酶来帮助家蚕消化食物，促进蛋白质、脂肪、淀粉和纤维素等物质的分解以供给家蚕正常的生长发育的营养需要，成为家蚕消化系统不可缺少的组成部分。

对于肠道微生物在昆虫抵抗病原菌过程中的作用的研究也有一些新的发现。徐红星等阐述了昆虫共生菌的抵御病原菌、抵抗寄生蜂和通过释放某些物质保护寄主不被捕食，以及通过促进昆虫体内的免疫系统来增强昆虫自身对外界病原菌的抵抗。其中关于家蚕的相关研究也早有进行，如鲁兴萌等从家蚕肠道中分离了4个肠球菌（Enterococcus）菌株，利用其进行家蚕微孢子虫的发芽抑制实验，实验发现肠球菌（Enterococcus）对其发芽有较好的抑制效果。另有研究发现家蚕食下添有微孢子虫的饲料后其体内的肠球菌数量有明显的增加，但菌种数和生化表型却有明显的下降，说明肠球菌（Enterococcus）与微孢子虫之间有着较为紧密的联系，这可能将是今后预防家蚕微粒子病发生的一个潜在途径。王晓强研究发现，家蚕肠道产脂肪酶的优势菌株单独发酵后给家蚕添食，能使得家蚕核型多角体病毒的感染率降低，这也说明了肠道优势菌株与家蚕的防御功能有着紧密联系。

此外，郎晓磊研究发现，通过利用添加了一定浓度的抗生素的人工饲料饲喂养家蚕可以得到无微生物的肠道环境，将苏云金杆菌（Bacillus mucilaginosus）毒素分别对肠道无微生物的和正常的家蚕进行生物测定发现，肠道无微生物的家蚕对毒素的敏感性更高，家蚕肠道微生物对苏云金芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）的抑制性的效果。这在相关的农作物虫害防治上有着很好的借鉴意义。

研究证明家蚕肠道微生物与蚕体免疫防御功能和营养吸收能力都有较为紧密的关系，因此，有效利用家蚕肠道微生物的抑制病原菌与助消化的功能将有望达到提高蚕茧产量的目的，可对蚕业的稳步发展带来积极影响。

3 家蚕肠道微生物的影响因素

随着对肠道微生物功能的不断的深入研究和了解，人们对肠道微生态环境越来越重视，影响肠道微生物稳定的因素也引起了人们的关注。研究人员针对家蚕在不同饲料、添食外原菌，改变环境因素和不同品种等条件下做出了相应的研究。

向芸庆利用了柘叶和桑叶分别对家蚕进行喂食，在四龄、五龄期从家蚕肠道中分离优势菌群，柘叶饲养的家蚕肠道中有29株菌株，桑叶饲养的家蚕肠道中有27株菌株，除了两种饲料饲养的家蚕肠道中共有的4种优势菌群，喂食桑叶的家蚕还有5种优势菌群，而喂食柘叶的家蚕却只有2种。桑叶饲养的家蚕肠道微生物类型要远比柘叶饲养的丰富。同时，通过将两种饲料喂食后在肠道内生长的不同的菌混合饲养家蚕，发现会引起家蚕的吐液甚至群体死亡，推测：不同饲料会引起家蚕肠道微生态结构性的变化和产生基于适应性的不同微生态种群。李冠楠等人通过筛选分离出两株可以同时分泌蛋白质酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶的菌株，并鉴定其为芽孢杆菌（Bacillus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。研究发现枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的产酶能力要强于芽孢杆菌（Bacillus），在对家蚕进行枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）添食之后，发现其会导致芽孢杆菌（Bacillus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）成为肠道微生物的优势菌，并在肠道内定植，改变菌群的结构。说明肠道菌之间存在着密切的互作关系。李冠楠在研究氟胁迫对家蚕的影响中发现氟胁迫后家蚕734品种肠道的产酶细菌有明显减少，优势菌种发生改变只有产脂肪酶的葡萄球菌属（Staphylococcus）占比较大，通过高通量测序发现肠道菌群的动态变化和蚕体对氟化物的耐性有相应的关联。

孙振丽研究BmCPV感染家蚕后其肠道微生物构成的变化情况，发现虽然肠道微生物整体的多样性有明显降低，但是肠球菌属（Enterococcus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）的数量却有增加，且肠球菌属的数量与其他优势菌种数量呈负相关。同时孙振丽还发现家蚕肠道微生物在经过短暂高温处理后也会发生优势菌群的更变，而且菌群丰度的变化与其免疫信号通路的重要基因表达量呈现一定的关系，说明短暂高温处理也会影响到肠道菌群结构。该研究通过比较野桑蚕和家蚕的肠道微生物优势菌群发现人工驯化影响了肠道微生物与蚕体对环境适应性和摄食性的关系。

杜贝贝利用16s rRNA克隆文库技术对家蚕肠道微生物测序，发现了高温处理后，大造品种的家蚕肠道微生物发生了优势菌群的变化，梭菌属（Clostridium）和乳球菌属（Lactococcus） 取代了鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）和铜绿假单胞菌属（P.aeruginosa）的优势地位。而且，大造和菁松两个品种的优势菌群差别较大，大造的肠道中红球菌属（Rhodococcus）和甲基杆菌属（Methylobacillus）占有优势，菁松则是梭菌属（Clostridium）为优势菌群。

研究表明，肠道微生物的影响因素对于调节家蚕肠道的益生优势菌群至关重要，可以通过创造各种有利因素来提高家蚕肠道的益生优势菌群，进而提高家蚕对营养的吸收和增强免疫防御能力，最终提高蚕茧产量。

4 昆虫肠道微生物研究

昆虫肠道微生物的研究以等翅目的昆虫研究较多，近年来逐渐增多了对各类农业害虫的的肠道微生物研究工作。2014年员超利用16s rRNA高通量测序技术分析白蚁的肠道微生物，选择性培养基筛选研究菌群，梯度凝胶电泳鉴定菌群的种类，确定了白蚁后肠内可以产出高效分解木聚糖的酶的类芽孢杆菌（Paenibacillus）。戴楠晶研究小菜蛾肠道微生物对苏云金杆菌（Bacillus mucilaginosus）的杀灭作用的影响，发现通过比较正常肠道微生物和Bt毒蛋白培养的肠道微生物的变化，筛选出两者中可培养的丰度有明显差异的菌群，添加到苏云金杆菌（Bacillus mucilaginosus）处理后的小菜蛾，其中普城沙雷菌（Serratia plymuthica）和泛菌属（Pantoea）细菌的浓度越高，Bt对小菜蛾的杀灭效果越差。徐阳研究不同发育阶段的日本弓背蚁的肠道微生物变化发现Blochmannia在各个发育阶段的肠道中都有出现，在卵、蛹、大工蚁、雄蚁和蚁后的肠道中居优势菌群地位，小工蚁和幼虫也有各自的优势菌群，结果表明大工蚁较其他发育阶段的肠道微生物种类更加多样化，日本弓背蚁的肠道微生物菌群种类和优势菌群也随着发育阶段变化而变化。Engel等发现诸如白蚁、蚂蚁和蜜蜂之类的社会性昆虫因为其社会互动的特性，较之其他昆虫肠道微生物，其肠道微生物中出现了一些特有并一致的菌群提供专门的营养和保护功能。Brune等也发现了白蚁的社会集群聚集的特性导致了其肠道微生物的进化与蟑螂的有所不同，较之蟑螂的肠道微生物受环境的选择影响，白蚁的社会性聚集的特性影响肠道与菌群的共同进化。

关于除家蚕外的其他昆虫的肠道微生物的研究中，针对昆虫特点利用了不同的研究方法和策略，这对家蚕的肠道微生物的研究将有着很好的参考借鉴意义。

5 展望

昆虫肠道微生物的研究目前仍然处于不断推进的阶段，对于微生物与宿主之间更复杂的关系尚不清楚，更深一层的微生物对宿主的功能更有待研究。一方面是由于肠道微生物涉及方面较多，多样性的微生物种群结构和多种功能存在极大的复杂性；另一方面从近年来的研究方法可以看出，随着生物技术的不断发展，肠道微生物的研究技术也从单一的形态观察鉴定发展到了分子生物学鉴定，包括诸如16S rRNA的分子检测技术、高通量测序技术、基因芯片等，相信随着技术的不断发展，肠道微生物的研究也会更深入。

这些相关的研究不仅在理论上解释某些生物现象，并在实践领域具有广阔的应用价值。如，以肠道微生物与宿主的共同进化为模型，研究选择性的环境下的生物进化规律。又譬如通过研发微生态制剂，改变家蚕肠道的优势菌群，使得中肠对饲料的吸收更充分，提高叶丝转化率，降低蚕业生产中的劳动成本，提高养蚕的整体经济效益。也可以通过农药与昆虫肠道微生物的特定互作引起的致死作用方面来研究有害昆虫的防控。

现阶段，昆虫肠道微生物的研究已取得了一定的成绩，相信随着研究的不断深入的研究，肠道微生物一定会在不久的将来大放异彩。

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