肠道病毒EV71感染致中枢神经系统损伤机制及治疗研究进展*

刘文娟，张　琼，曹　霞

昆明医科大学第二附属医院(昆明　650101)

肠道病毒EV71感染致中枢神经系统损伤机制及治疗研究进展*

刘文娟，张琼，曹霞△

昆明医科大学第二附属医院(昆明650101)

【关键词】肠道病毒71型；中枢神经系统损伤；发病机制

肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)具有高度的嗜神经性，是儿童手足口病(Hand-Foot-Mouth disease，HFMD)和疱疹性咽峡炎的主要病原体之一，感染严重者可引起中枢神经系统损伤和神经源性肺水肿(neurogenic pulmonary edema，NPE)等病变，甚至危及生命[1]。研究[2]表明，近年来EV71在亚太地区流行呈上升趋势，且在我国局部地区也发生过EV71大规模流行。目前，EV71已成为致婴幼儿中枢系统病变的最主要病毒病原[3]。本文就EV71相关病原学、神经系统损伤、NPE发病机制及预后、病理变化及EV71疫苗研究进展作一综述，为EV71相关研究提供理论依据。

1病原学

EV71是一种正链RNA病毒，属于小RNA病毒科肠道病毒属A型。世界上第一株EV71(BrCr株)于1969年从加利福尼亚一名HFMD患儿脑组织中分离出来[4]。中国科学院武汉病毒研究所于1995年从HFMD患儿粪便中分离出两株EV71病毒[5]。EV71是HFMD及疱疹性咽峡炎的主要病原之一，可引起各类中枢神经系统损伤及致死性NPE，已引起国内外学者的广泛关注。

EV71病毒颗粒是20面立体对称球形结构，直径约30 nm，无包膜和突起，由60个亚单位构成，每个亚单位由4种结构蛋白(VP1～VP4)组成。VP1～VP4包绕着由7 500个核苷酸构成的EV71基因组正链RNA，其中VP1、2、3暴露在病毒颗粒表面，而VP4则与病毒核心紧密连接。EV71颗粒表面没有类脂膜，可抵御常见的消毒剂，但是对高温(56 ℃， 30 min)、紫外线照射及各种强氧化剂敏感，能被快速灭活。EV71在体外可存活较久， 4 ℃能存活1年，-20 ℃可长期保存。

Brown等[6]于1999年首次将EV71划分为A、B、C基因型，各基因型内部差异在6.0%～11.0%，两型之间的差异在16.5%～19.7%，说明存在不同基因型的共存及基因变异。实验研究[7]表明，2004年前我国流行的主要是C4b型，之后主要是C4a亚型。

人类是EV71唯一的传染源，主要经胃肠道(粪-口、食物污染和水)或呼吸道(飞沫、咳嗽等)传播，发病以婴幼儿为主。在发病前数天，粪便及咽喉部即可发现病毒，此时即有传染力，且一般在发病后一周内传染力最强，潜伏期为2～10 d，平均3～5 d。

2EV71致中枢神经系统损伤

2.1无菌性脑膜炎

无菌性脑膜炎是除细菌或真菌以外的因素导致的脑膜炎症。患儿表现为HFMD或疱疹性咽峡炎的同时，可伴有发热、精神不佳、嗜睡和易激惹等症状。Chang等[8]对61例EV71感染伴无菌性脑膜炎患儿为期3年的随访发现，无菌性脑膜炎患儿均完全康复，无相关后遗症。流行病学调查发现，EV71 感染后伴发无菌性脑膜炎，预后良好[9]。

2.2脑炎

脑炎是EV71直接感染脑组织引发的炎性病变，其临床特点与病毒性脑炎相似，主要表现为意识障碍、行为异常和惊厥发作等，婴幼儿多首先表现为发热、惊厥等，预后相对良好。胡琼文等[9]对32例EV71感染伴脑炎患儿3年随访后发现，只有1例患儿出现轻度面神经瘫痪，痊愈率高达96.8%。陈庆会[10]对81例脑炎患儿随访发现，仅有1例患儿出现左上肢迟缓性瘫痪，余患儿均治愈。

2.3脑干脑炎

脑干脑炎是EV71直接侵犯脑干引发的炎性病变，主要累及脑干背侧及其相邻的神经组织，主要表现为共济失调、呼吸节律失调、流涎、呛咳、眼球震颤、意识障碍、呕吐、吞咽困难和心动过速等症状。根据临床症状严重程度可分为3级，严重者病程进展迅速，可发生NPE、肺出血和循环衰竭，甚至危及生命，预后差。陈冉冉等[11]对82例EV71感染伴发脑干脑炎患儿3年的随访发现，14例(17%)患儿出现后遗症，主要包括肢体无力、肢体抽搐、性格改变、睡眠呼吸障碍并吞咽障碍等。Huang等[12]对63例脑干脑炎患儿随访3年发现，9例存在后遗症，主要包括运动协调障碍、小脑功能障碍和颅神经麻痹等，3例死亡。

2.4急性迟缓性麻痹(acute flaccida paralysis，AFP)

AFP是EV71感染致下运动神经元性瘫痪，临床症状与脊髓灰质炎性麻痹类似，主要表现为急性双侧或单侧肢体无力、肌力减低，腱反射减弱或消失。有研究[13]报道，EV71感染致AFP发病率为2%～8%，患者预后可分为完全恢复、遗留肢体无力或永久性肢体瘫痪，甚至死亡。彭炳蔚等[14]对16例AFP患儿行3个月的康复治疗后，仍有11例(69%)存在肢体瘫痪。Liu等[15]报道，35例EV71感染患儿中有9例伴发AFP，1例放弃治疗，1例死亡，7例经过治疗后肢体肌力均有不同程度恢复。研究发现，EV71感染伴发AFP多为可逆性病变，经过积极治疗可恢复，且单侧下肢瘫痪较双下肢或四肢瘫痪恢复较快。

2.5神经精神发育障碍

患儿神经精神发育障碍程度与临床严重程度相关，主要表现为神经发育延迟、认知功能障碍、言语功能障碍和运动协调障碍等，严重者可同时存在多项功能障碍。Chang等[9]随访142例EV71感染患儿发现，43例伴发无菌性脑膜炎患儿神经发育均无明显异常，但48例伴发严重CNS患儿则有22例出现不同程度的神经发育延迟，严重影响患儿的身心发育。CNS病变时可因基底核区、前额叶和小脑等功能异常导致患儿出现注意力缺陷多动障碍。Gau等[16]采用CTRS量表评估81例EV71感染伴CNS损伤患儿发现，该类患儿发生注意力缺陷多动障碍的比例明显升高，并且多数患儿需要药物控制。Tsou等[17]通过儿童运动评定成套试验(MABC)评估107例EV71感染伴脑干脑炎患儿发现，95%的II期及IIIa患儿运动协调能力无明显异常，但是IIIb患儿则存在明显的粗细运功功能异常。另外，Chang等[9]对48例EV71感染伴脑干脑炎患儿进行WISC测试发现，38例>2岁患儿的言语理解分数为(104±12)分，而10例<2岁的则为(90±12)分， 提示EV71感染伴CNS损伤可能会影响患儿的言语理解能力，特别是对<2岁的患儿影响更明显。

3EV71致CNS损伤发病机制

Lin等[18]通过对EV71感染死亡患儿进行尸检发现，患儿CNS病变部位存在EV71及淋巴细胞，而李军等[19]通过EV71感染小鼠模型也有类似发现，提示EV71可直接造成CNS损伤。EV71可能通过血液途径、淋巴途径、神经元通路直接累及CNS，也可能通过损伤机体的免疫系统进而加重患儿的病情[20]。

目前的研究[20]发现，在感染者的胃内容物、肠黏膜及粪便中均可分离出EV71病毒。Lin等[18]和郝博等[21]均通过尸检在感染者尸体CNS中发现EV71及炎症存在，同时通过病理检查发现患儿肠系膜淋巴结明显肿大，小肠及结肠的淋巴组织也明显增生，故推测EV71可能通过淋巴液途径上行累及CNS。研究结果还发现，EV71主要分布在星形胶质细胞中，而神经元中也有少量分布。Yip等[22]认为，EV71可能通过血液途径累及CNS，感染CNS时存在病毒血症期。但Chang等[9]发现，小鼠口服EV71可引发小鼠持续病毒血症期，同时也增加小鼠血脑屏障的通透性，但小鼠脑组织的病毒量却没有明显增加，这提示血源性途径可能并非是EV71累及CNS的主要途径，且目前也没有在EV71感染患者血液中分离出EV71颗粒的报道。

EV71的高度嗜神经特性与病毒颗粒表面的衣壳蛋白有关，故有学者推测EV71侵入机体后可能通过逆向轴突运输途径累及CNS[23-24]。Wong等[24]在患者的神经元及轴突上发现EV71抗原的存在，进一步证实EV71可直接累及神经元或轴突。Chen等[25]通过动物实验也证实神经通路的逆行轴突运输可能是EV71累及CNS的主要方式。EV71感染神经细胞后还可通过激活凋亡途径诱导神经细胞凋亡进而损伤脑组织，甚至是遗留后遗症。

EV71多感染婴幼儿，而婴幼儿的免疫系统并不成熟，进一步增强了EV71对婴幼儿感染的易感性。EV71感染伴脑干脑炎患儿外周血中CD4+、CD8+T细胞均明显降低，提示EV71感染可损害机体的细胞免疫功能。而免疫功能下降，机体清除体内病毒的能力也降低，导致病情加重。Shih等[26]研究认为，EV71感染伴CNS损伤与补体的激活有关， EV71感染神经细胞后，补体C3a、C4a等明显升高，也可同时通过旁路激活途径激活C5a进而刺激巨噬细胞分泌趋化因子诱导大量多核中性粒细胞聚集活化，最终导致组织损伤。因此，深入研究细胞免疫和补体激活在EV71感染伴CNS损伤中的作用，有益于EV71发病机制的探索。

Ho等[27]认为，细胞微环境会影响宿主细胞对EV71的易感性，而氧化应激是重要因素之一；氧化环境中，EV71复制更活跃，但在抗氧化剂的干预下，EV71的复制能力则受到明显限制，故推测EV71对机体的易感性与宿主微环境的氧化还原状态有关。另有研究[28]报道，EV71可能与神经细胞表面清道夫受体B2直接结合，介导EV71累及神经细胞，故推测清道夫受体B2在EV71感染中发挥重要作用。

4EV71感染的治疗

临床上尚没有治疗EV71的特异性药物，主要以对症支持治疗为主，目前关于抗EV71药物的研究主要包括病毒衣壳结合制剂、蛋白酶抑制剂、RNA多聚酶抑制剂、免疫球蛋白及单克隆抗体治疗等。

4.1病毒衣壳结合制剂

EV71病毒衣壳是由4种衣壳蛋白(VP1～VP4)组成的五聚体样结构。咪唑啉酮衍生物BPROZ-194可通过与EV71病毒颗粒衣壳蛋白VP1结合而阻碍病毒对宿主细胞的吸附和脱壳，进而发挥抗病毒效应[29]。体外实验表明，该药物能抑制EV71感染导致的细胞病变效应，且细胞毒性很低；当衣壳蛋白VP1第192位的缬氨酸突变为甲硫氨酸时，EV71可对该类药物发生耐药性[30]。

4.2蛋白酶抑制剂

3C蛋白酶是EV71病毒复制所必须的一种特异性蛋白酶，基因组学研究[31]发现，编码3C蛋白酶的基因序列呈高度保守，故通过抑制3C蛋白酶可能成为治疗EV71的重要靶点。芦平曲韦是针对3C蛋白酶研发的药物之一，也是最有可能成为有效的抗EV71药物之一[10]。体外实验显示，芦平曲韦具有抗EV71作用(EC50=1.55 μmol/L)[32]。Kuo等[33]研发的化合物10b是在芦平曲韦的基础上合成的3C蛋白酶抑制剂，且体外实验表明10b具有显著的抗EV71效应，但其是否能在体内发挥抗EV71效应有待进一步的动物研究。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对泛素蛋白酶体系统(UPS)具有抑制效应。有研究[34]报道，PDTC可通过抑制EV71感染细胞的UPS发挥抗EV71作用。Shang等[35]发现，AG7088是一种蛋白酶抑制剂，具有协同抗EV71作用，可联合其他抗病毒药物治疗EV71。

4.3RNA多聚酶抑制剂

金黄三羧酸是一类具有抑制RNA多聚酶的阴聚离子复合物，可通过影响病毒的复制达到抗病毒的作用。有学者通过体外实验发现，可通过抑制EV71病毒的RNA多聚酶发挥抗EV71效用(EC50=2.9 μmol/L)，且对宿主细胞的影响较小[36]。Velu等[37]发现，BPR-3P0128是一种羧酸类化合物，也可通过抑制EV71的RNA多聚酶，在病毒感染早期明显抑制EV71复制，具有明显的抗病毒效应。

4.4免疫球蛋白治疗

经静脉免疫球蛋白(IVIg)注射对免疫缺陷或免疫低下的患者具有积极的增强免疫或抗感染的作用，主要应用于自身免疫性疾病如ITP或川崎病等，而免疫球蛋白IgGs抗EV71的效用也是目前的研究热点。Wang等[38]发现,免疫球蛋白可通过调节EV71感染者的炎症因子从而快速改善患者的全身症状，特别是对于免疫低下患者，具有明显的抗EV71效应。研究[39]还发现，免疫球蛋白内的中和抗体亦具有一定程度的抗EV71作用。目前免疫球蛋白主要从健康人群血清中获取，不同的人群或不同的获取方式都会影响该疗法的抗EV71作用及稳定性。因此对于IgGs应用于抗EV71的机制及方案仍有待进一步研究及完善。

4.5单克隆抗体治疗

单克隆抗体疗法与IVIg疗法类似，也是当前热门的免疫学治疗方法。单克隆抗体可根据病毒表面抗原或变异病毒抗原进行制定，进而可以特异性地对抗把抗原病毒。有研究[40]报道，可通过单克隆抗体治疗EV71，对于存在多个亚型抗原的病毒，可以同时制定多个特异性抗体进行治疗。目前已研发出可以针对11种病毒抗原亚型的单克隆抗体，如Mab51、10D3等，该类抗体均属于IgM[41]。其中Mab51主要是针对EV71衣壳上VP1蛋白的KEQK氨基酸序列位点，而10D3则主要是中和VP3上高度保守的“knob”区域。小鼠体内实验均证实Mab51、10D3具有显著的抗EV71作用[42]。因此，众多学者认为单克隆抗体对于治疗EV71具有重要的应用前景。

5EV71疫苗研究进展

疫苗是预防传染性病毒感染最安全有效的方式，常见的疫苗载体有失活疫苗、减毒活疫苗、病毒样颗粒疫苗、DNA疫苗和重组亚单位疫苗等。目前虽然对EV71疫苗的研究已取得一定成果，但仍没有针对性的疫苗面世。减毒活疫苗对中枢系统有轻微影响，且疫苗可能有毒力恢复的风险，限制了减毒活疫苗的应用，故有待进一步研究改善其安全性[41]。DNA疫苗的研究尚处于起步阶段，旨在将病毒相关免疫蛋白的基因片段转入质粒载体而构建疫苗，接种后通过机体内表达相关抗原从而引起体液及细胞免疫[42]。Mat-Rahim等[43]针对EV71-VP1蛋白基因序列制作DNA疫苗，接种小鼠后能诱导产生更高滴度的抗体。另有研究[44]报道，DNA疫苗可一定程度上增强机体的体液及细胞免疫，具有一定抗EV71作用，但效果较失活疫苗差，这可能与DNA疫苗在机体内表达水平及病毒变异有关。且DNA疫苗作为外源性核酸物质是否会影响机体的遗传表观尚不确定，故对于DNA疫苗的研发应用仍将面临众多问题[44]。重组亚单位疫苗是将EV71病毒衣壳蛋白VP1作为免疫靶点，小鼠体内实验显示，重组亚单位疫苗具有一定的抗EV71效果，但因E不同亚型V71病毒VP1蛋白抗原性差异较大，故重组亚单位疫苗的交叉保护能力有限。失活疫苗和病毒样颗粒疫苗是目前制作及应用相对成熟的免疫方式，加强研发这两类疫苗仍是目前的主流。

5.1失活疫苗

失活疫苗是一种保留病原体免疫抗原性的疫苗，其安全性高，但需多次免疫。Zhu等[45]研发的首个EV71灭火疫苗经过III期临床试验结果表明，该疫苗对EV71感染导致的HFMD预防率达90%，具有高度的免疫原性及安全性。猕猴体内实验表明，接种3次EV71失活疫苗后，体内的抗体效价达到高峰，且其中和抗体滴度一直保持100%，直到实验结束[46]。Wu等[44]研究显示，失活EV71疫苗接种后的小鼠对EV71具有显著抗性，且失活疫苗的保护性明显高于DNA疫苗及重组亚单位疫苗。综合目前的研究成果，深入研究EV71灭火疫苗具有广泛的应用前景。但失活疫苗也存在一定的缺点，如因EV71存在较高的基因变异，制备同时具有广谱抗原性的疫苗将是该疫苗研发所面临的巨大挑战，同时失活疫苗主要是诱导体液免疫，对于细胞免疫诱导不足等也会制约该类疫苗的应用[45,47]。因此进一步完善失活疫苗，或研发其他免疫形式的疫苗也是必要的。

5.2病毒样颗粒疫苗

病毒样颗粒疫苗(virus-like particle， VLP)是由EV71病毒的衣壳蛋白构成的，不含有病毒的核酸成分，但保留了病毒的表面抗原性，进而可以诱导体液和细胞免疫，不存在致病风险且安全性高，是一种具有良好应用前景的疫苗形式。当前已有多种成熟的VLP疫苗应用于临床，如人乳头瘤病毒、乙肝病毒、登革热病毒和流感病毒等[48]。Chung等[49]通过动物实验表明，EV71 VLP疫苗可诱导小鼠持续产生高滴度中和抗体，同时还可诱导细胞免疫应答，产生IL-4和IL-2等抗炎因子，增强抗EV71作用；研究还发现，与失活疫苗相比，VLP疫苗抗EV71效应更好，但受提纯方式限制，不易获得高纯度的VLP疫苗，目前新加坡有学者正在进行VLP提纯方法的研究。另有报道[50]显示，EV71 VLP疫苗免疫的母鼠可将抗EV71抗体传递给乳鼠，90%以上的乳鼠可在受到致死剂量EV71感染时获得保护，而对照组乳鼠则全部死亡。综合当前研究结果，VLP疫苗具有高免疫原性及安全性的优点，但疫苗的纯化方式仍有待进一步改善。

EV71感染是目前威胁婴幼儿健康的最为严重的病原体之一，今后的研究仍需重点关注以下几个方面：1)建立科学完善的EV71流行监测系统，以防EV71大规模流行；2)建立EV71的快速诊断措施，以及时确诊可疑患者，为患者的早期治疗争取最佳时机；3)建立科学的动物模型，加强研究有效的抗EV71药物或预防性疫苗；4)通过动物模型或分子研究探索EV71与宿主相互作用的途径及机制，进而为抗EV71药物及疫苗的研发提供理论依据。

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doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.02.030

*基金项目:国家自然科学基金(No:31160206)

通信作者：△曹霞，E-mail：363768712@qq.com

【中图分类号】R725.1

【文献标志码】A

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160221.2012.022.html

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