果树转基因研究进展

王新平，茹慧玲，孙慧英，王新生，杨兆亮，杨雪瑞

（山西省农业科学院果树研究所，山西太谷030800）

果树转基因研究进展

王新平，茹慧玲，孙慧英，王新生，杨兆亮，杨雪瑞

（山西省农业科学院果树研究所，山西太谷030800）

转基因技术在果树遗传改良方面具有重要意义。目前已报道的转基因方法几乎都能成功得到转基因植株，但不同的方法间转化效率存在很大差异，且对不同的果树而言，同一方法的转化效率也不尽相同。迄今为止，主要的转基因方法有农杆菌介导法和外源基因直接导入法两大类，且以农杆菌介导法应用最为广泛。文章对这2种方法及取得的成果进行了阐述，并对研究中存在的问题提出了建议和展望，以期为果树品种改良提供依据。

果树；转基因；农杆菌；Ti质粒；外源基因

我国自商代开始栽培果树，1949年开始进行果树育种研究，传统的育种方法主要有引种、选优、实生选种、杂交选种、辐射诱变和芽变等[1]。果树的童期长、杂合度高、自交不亲和等问题，给育种工作造成很大困难。1983年烟草转基因植株的成功获得[2]，为果树的遗传改良开辟了一条新的途径。1988年，McGranahan等[3]成功获得了具有GUS基因的核桃转基因植株，成为世界首例转基因果树。转基因技术与常规育种的结合，不仅使果树的育种周期变短、后代选择稳定，而且增强了育种的目的性，大大提高了育种效率。近年来，随着生物技术的飞速发展，已出现多种植物转基因技术[4]，且其在果树育种方面的应用也日益广泛，并取得了很大进展。

笔者对果树转基因方面取得的研究进展进行了阐述，以期为果树品种改良提供参考。

1 果树常用转基因方法

目前，有关果树转基因的方法已有很多报道，且已报道的方法都能成功得到转基因植株。但不同的转基因方法间转化效率存在很大差异，即使同一种方法，对不同的果树而言，其转化效率也不尽相同。了解各种转基因方法，在众多方法中选择针对某一果树的最适方法，并对影响其转化效率的关键因素进行优化，提高遗传转化率，是转基因技术应用于果树遗传改良的关键。迄今为止，主要的转基因方法有两大类：农杆菌介导法和外源基因直接导入法。

1.1 农杆菌介导法

农杆菌介导法是目前使用最为广泛的体系[5]，该方法以农杆菌为媒介，将目的基因通过载体上的特定区域导入细胞，并整合到染色体中[6-7]。常用的农杆菌菌株主要有发根农杆菌（Agrobacterium rhyzogines）和根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。其中，根癌农杆菌的Ti质粒应用最为广泛，该方法出现较早、技术成熟、转化效率高、操作简单，加之绝大多数的果树对农杆菌较为敏感，因此，农杆菌介导法成为果树转基因的主要方法[8]，目前得到的转基因果树中绝大多数是通过这一方法实现的。

农杆菌介导法已在核桃[3，9-10]、葡萄[11-15]、苹果[16-22]、草莓[23-28]、梨[29-30]、柑橘[31-34]等果树上取得成功。McGranahan等[3]首次利用核桃的体胚发生系统进行外源基因的转移，成功获得了抗卡那霉素的转基因植株，但转化效率低，方法繁琐。Dandekar等[9]对转化方法进行了改进，McGranahan等[10]于1990年采用这一方法再次获得核桃转基因植株，且提高了转化效率，加快了选择进度。1989年，黄学森等[11]利用改进的Ti质粒为载体，获得了具有卡那霉素抗性和胭脂碱合成酶基因（NOS基因）的葡萄转基因植株，成为我国首例成功转入外源基因并使其性状表达的果树。此后，农杆菌介导的转基因技术在葡萄上的应用日益广泛，目前获得的绝大多数抗病毒转基因葡萄都是通过此方法获得的[12]。李金凤等[13]研究表明，葡萄砧木5BB在农杆菌侵染4 min、共培养2 d时，不定芽的再生率和GUS瞬时表达率均较高。此外，采取一些辅助手段，如共培养前对受体材料进行预培养以及添加乙酰丁香酮（AS）可提高转化效率[14-15]。苹果的转基因研究始于1989年，James等[16]首次获得的转基因绿袖苹果，此后相继在M26[17]、元帅[18]、嘎啦、Braeburn[19]、Elstar[20]、富士[21]等众多个品种中取得成功。张志宏[22]研究认为，对于乔纳金苹果的叶片而言，琥珀碱型菌株EHA105远比章鱼碱型菌株LBA4404的转化率要高。继核桃和苹果之后，草莓是世界上第3个获得转基因植株的果树[23]。1990年Nehra等[24-26]以Redcoat的愈伤组织和叶盘为材料，成功将GUS基因和NptⅡ基因导入草莓植株，转化率分别为3%和6.5%。此后，James等[27]以双元Ti质粒载体pBIN6和pSS1转化草莓的叶片和叶柄，获得了再生植株。Oosumi等[28]以森林草莓种子萌发42～49 d、未展开的三小叶为材料，将hpt基因导入草莓，并获得100%的转化率。梨的转基因研究起步较晚，1996年Mourgues等[29]首次通过农杆菌介导法成功获得具有外源GUS基因和NptⅡ基因的康弗伦斯梨，且转化率高达42.7%。此后，在帕西、杜康、Bourre Bosc、杜梨等品种中也取得成功[30]。1989年Kobayashi等[31]以柑橘原生质体为受体，成功获得转基因的胚性愈伤组织，此后，柑橘的遗传转化研究取得了较大发展，先后在枳、甜橙、宽皮橘、柚、柠檬等柑橘类果树中获得转基因植株[32]。1998年Cervera等[33]首次用成年甜橙的新抽枝条为受体，获得转基因植株，但转化率较实生苗低，此后中国农科院国家柑橘品种改良中心以甜橙成年树的腋芽作为转化材料，将转化率提高到了10%[34]。

1.2 外源基因直接导入法

与农杆菌介导法不同，外源基因直接导入法是通过一定的技术手段和方法可直接将目的基因导入受体或组织细胞，从而方便快捷地完成植物的基因转化[35]。目前，果树上常用的外源基因直接导入法主要有电击法和基因枪法。

1.2.1 电击法也叫电穿孔法，其原理是以瞬时高压电脉冲作用于植物细胞，使细胞膜产生微孔，从而促进外源基因进入细胞内部，并与植物基因组进行整合。与农杆菌介导法相比，电击法适用于所有的细胞，且操作简单快捷、可直接将目的基因导入受体的原生质体中，但该方法需要昂贵的仪器，细胞致死率高，DNA和细胞用量大，且稳定性和重复性较差。目前，由电击法获得的转基因果树有草莓[36]、柑橘[37]、苹果[38]等。1992年，Nyman等[36]对草莓原生质体进行20 ms 400 V/cm的电击，在10 μg/mL的潮霉素选择压获得具有GUS基因的草莓愈伤组织。Hidaka等[37]于1993年利用电击法将GUS基因导入柑橘愈伤组织，但没有获得再生植株。Hyung等[38]对富士苹果进行30 ms 200 V/cm的电击，使GUS基因在叶肉原生质体中瞬时表达。

1.2.2 基因枪法基因枪法是指把含有目的基因的金属颗粒高速射入受体细胞中，使外源基因与受体细胞的基因重组，从而获得转化植株。该方法可用于任何植物组织，且报告基因的瞬时表达便于分析基因表达的组织特异性，但获得稳定转化的频率较低。Klein等[39]最早采用该方法将烟草的RNA导入洋葱细胞，目前利用该方法进行遗传转化的果树有苹果、葡萄、香蕉、荔枝等[40]。Yao等[41]利用基因枪法将GUS基因导入橘柚的悬浮细胞中，并指出将细胞用高渗溶液预处理后可显著提高转化效率。Hebert等[42]用包有GUS基因和NptⅡ基因的微粒轰击葡萄胚性培养物，获得了转基因植株。Scorza等[43-44]先用基因枪轰击无核白葡萄体细胞胚2次后，再与含外源基因的农杆菌共培养，从而获得具有报告基因、Shirva-1基因或番茄环斑病毒CP基因的植株。

2 问题与展望

经过众多科研工作者近30 a的努力，果树的转基因研究已取得很大的成就，通过转基因技术改变的农艺性状主要集中在提高抗病虫能力、提高抗逆性、缩短童期、促进树体矮化、分枝与生根以及增强果实耐储性等方面。但是迄今为止，果树的转基因技术在基因转移、遗传选择、高频再生体系建立等方面仍然存在一定的困难。由于转化效率低、转基因植株再生率低等技术原因，目前获得的商品化转基因果树很少，远不如其他转基因农作物。针对这些问题，在今后的研究中，应该探索研发高效的转化体系，提高转基因果树的应用性；此外，还应加大具有某种特殊功能的目的基因分离克隆的研究力度，如与果实产量、品质、抗性等相关的基因，不应局限于转化现有的目的基因。随着果树分子生物学和生物技术的快速发展，将有更多的功能基因应用到果树育种中，并最终将这些技术成果应用到大田生产中。

［1］高敏霞，叶新福.植物组织培养在核果类果树上的应用研究进展[J].中国热带农业，2015（3）：107-108.

［2］杨广东，李燕娥，郭瑜敏.我国蔬菜转基因技术研究进展[J].山西农业科学，2003，31（3）：59-64.

［3］McGranahan G H，Leslic C A，Uratsu S L.Agrobacterium-mediated transformation of walnut somatic embryos and regeneration of transgenic plants[J].Bio Technology，1988，6：800-804.

［4］张彬，张怀渝.植物转基因技术及其应用[J].安徽科技，2005（5）：54-56.

［5］陆璐.甜瓜ACC氧化酶cDNA克隆及其反义序列转化栽培品种[D].杨凌：西北农业大学，1999.

［6］萨姆布鲁克，黄培堂.北京分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，2002.

［7］翟礼嘉.现代生物技术导论[M].北京：高等教出版社，施普林格出版社，1998：126-127.

［8］刘淑芹，王铭.我国果树转基因的研究概况[J].北方果树，2008（5）：1-4.

［9］Dandekar A M，McGranahan G H，Leslie C A，et al.Agrobacterium-mediated transformation of somatic embryos as a method for the production of transgenic plants[J].J Tissue Culture Methods，1989，12（4）：145-150.

［10］McGranahan G H，Leslie C A，Uratsu S L，et al.Improved efficiency of the walnut somatic embryo gene transfer system[J].Plant Cell Rept，1990，8（8）：512-516.

［11］黄学森，Mullis MG.用生物工程技术将外源基因转入葡萄[J].遗传，1989，11（3）：9-11.

［12］任芳，董雅凤，张尊平，等.葡萄抗病毒转基因研究进展[J].园艺学报，2013，40（9）：1633-1644.

［13］李金凤，杨丽娜，周蓓蓓，等.葡萄砧木5BB农杆菌介导法的遗传转化体系[J].江苏农业学报，2009，25（3）：715-717.

［14］孙仲序，陈受宜，王建设，等.农杆菌介导BADH基因转化葡萄的研究[J].果树学报，2003，20（2）：89-92.

［15］邓杰，曹银生，刘彩玉，等.农杆菌介导霞多丽葡萄胚性细胞系遗传转化条件的优化[J].果树学报，2008，25（2）：236-239.

［16］James D J，Passey A J，Barbara D J，et al.Genetic transformation of apple（Malus pumila Mill）using a disarmed Ti-binary vector[J]. Plant Cell Rep，1989，7：658-661.

［17］Maheswaran G，Welander M，Hutchinson J F，et al.Transformation of apple rootstock M26 with Agrobacterium tumefaciens[J].J Plant Physiol，1992，139（5）：560-568.

［18］Sriskandarajah S，Goodwin P B，Speirs J.Genetic transformation of apple scion cultivar' Delicious' via Agrobacterium tumefaciens[J]. Plant Cell Tiss Org，1994，36（3）：317-329.

［19］Schaart J G，Puite K J，Kolova L，et al.Some methodological aspects of apple transformation by Agrobacterium[J].Euphytica，1995，85（1/3）：131-134.

［20］Puite K J，Schaart J G.Genetic modification of the commercial apple cultivars Gala，Golden Delicious and Elstar via an Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation method[J].Plant Sci，1996，119（1/2）：125-133.

［21］裴东，田颖川，刘群禄，等.苹果叶片再生的改进及抗虫基因植株的获得[J].河北农业大学学报，1996，19（4）：23-27.

［22］张志宏.苹果叶片离体再生不定芽及遗传转化研究[D].沈阳：沈阳农业大学，1996.

［23］秦永华，张上隆.草莓转基因研究进展[J].遗传，2007，29（2）：150-156.

［24］Nehra N S，Stashnoff C.Direct shoot regeneration from strawberry leaf disks[J].J Amer Soc Hort Sci，1989，114（6）：1014-1018.

［25］Nehra N S，Chibbar R N，Kartha K K，et al.Genetic transformation of strawberry by Agrobacterium tumefaciens using a leaf disk regeneration system[J].Plant Cell Rep，1990，9（6）：293-298.

［26］Nehra N S，Chibbar R N，Kartha K K，et al.Agrobacterium-mediated transformation of strawberry calli and recovery of transgenic plants[J].Plant Cell Rep，1990，9（1）：10-13.

［27］James D J，Passey A J，Barbara D J.Agrobacterium-mediated transformation of the cultivated strawberry（Fragaria×anannassa Duch）using disarmed binary vectors[J].Plant Sci，1990，69：79-94.

［28］Oosumi T，Gruszewski H A，Blischak L A，et al.High-efficiency transformation of the diploid strawberry（Fragaria vesca）for functional genomics[J].Planta，2006，223（6）：1219-1230.

［29］Mourgues F，Chevreau E，Lambert C，et al.Efficient Agrobacterium-mediated transformation and recovery of transgenic plants from pear（Pyrus communis L.）[J].Plant Cell Reports，1996，16：215-219.

［30］刘翠琼，汤浩茹.梨叶片培养与转基因研究进展[J].果树学报，2003，20（5）：374-378.

［31］Kobayashi S，Uchimiya H.Expression and integration of a foreign gene in orange（Citrus sisnensis Osb.）protoplasts by direct DNA transfer[J].Jpn J Get，1989，64：91-97.

［32］彭爱红，何永睿，许兰珍，等.柑桔转基因研究进展[J].热带作物学报，2011，32（7）：1381-1387.

［33］Cervera M，Juarez J，Navarro A，et al.Genetic transformation and regeneration of mature tissues of woody fruit plants bypassing thejuvenile stage[J].Transgenic Research，1998，71：51-59.

［34］He Y R，Chen S C，Peng A H，et al.Production and evaluation of transgenic sweet orange（Citrus sinensis Osbeck）containing bivalent antibacterial peptide genes（Shiva A and Cecropin B）via a novel Agrobacterium-mediated transformation of mature axillary buds[J].Scientia Horticulturae，2011，128（2）：99-107.

［35］王关林.植物基因工程原理与技术[M].北京：科学出版社，1998.

［36］Nyman M，Wallin A.Transicent gene expression in strawberry（Fragaria×ananassa Duch.）protoplasts and the recovery of transgenic plants[J].Plant Cell Rep，1992，11：105-108.

［37］Hidaka T，Omura M.Transformation of citrus protoplasts by electroporation[J].J Jpn Soc Hort Sci，1993，62：371-376.

［38］HyungNL，Lee CH，KimS B.Foreign gene trangfer usingelectroporation and transient expressing in apple（Malus domestica Borkh.）[J].Acta Hort，1995，392：179-185.

［39］Klein T M，Wolf E D.High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells[J].Nature，1987，327：70-73.

［40］刘艳红，房经贵，陶建敏，等.果树基因转化技术的选用和转基因植株的鉴定与性状分析[J].中国农学通报，2008，24（8）：43-49.

［41］Yao J L，Wu J H，Gleave A P，et al.Transformation of citrus rembryogenic cell using particle bombardment and production of transgenic embryos[J].Plant Sci，1996，113：175-183.

［42］Hebert D，Kikkert J R，Smith F D，et al.Optimization of biolistic transformation of embryogenic grape cell suspensions[J].Plant Cell Reports，1993，12（10）：585-589.

［43］Scorza R，Cordts J M，Ramming D W，et al.Transformation of grape（Vitis vinifera L.）zygotic-derived somatic embryos and regeneralion of transgenic plant[J].Plant Cell Reports，1995，14（9）：589-592.

［44］Scorza R，Cordts J M.Producing transgenic' Thompson Seedless' grape（Vitis vinifera L.）plants[J].Journal of the American Society for Horticultural Science，1996，12（4）：616-619.

Research Progress of Transgenic Fruit Trees

WANG Xin-ping，RU Hui-ling，SUN Hui-ying，WANG Xin-sheng，YANG Zhao-liang，YANG Xue-rui
（Institute of Pomology，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taigu 030800，China）

The transgenic technology has important significance in the genetic improvement of fruit trees.Almost all transgenic method that have been reported can be used to obtain transgenic plants.There were differences between the different methods,and the transformation efficiency of the same method was not the same for different fruit trees.There were two major categories of transgenic method,Agrobacterium-Mediated and direct induction of exogenous DNA.The method most widely used was Agrobacterium-Mediated. In this paper,the two methods and the research results were described,and the existing problems and the research prospects were also discussed to provide the basis for the improvement of fruit varieties.

fruit trees;transgenic;Agrobacterium；plasmid Ti;exogenous gene

S66

A

1002-2481（2016）01-0123-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.01.32

2015-08-12

王新平（1974-），女，山西祁县人，研究实习员，主要从事果树育种与生物技术研究工作。