慢性心衰大鼠心肌间质与交感神经重塑机理及中药联合运动干预影响的实验研究*

马 金，张 艳，赵守彰

(1.辽宁医药职业学院，沈阳 110101;2.辽宁中医药大学，沈阳 110032)

慢性心衰大鼠心肌间质与交感神经重塑机理及中药联合运动干预影响的实验研究*

马 金1，张 艳2，赵守彰1

(1.辽宁医药职业学院，沈阳 110101;2.辽宁中医药大学，沈阳 110032)

目的:通过建立慢性心衰大鼠模型，利用益气活血中药及运动训练联合干预，探讨慢性心衰心肌间质与交感神经重塑的机理及防治慢性心衰的新途径。方法:以冠脉结扎法配合力竭式游泳、减食等方法塑造慢性心衰大鼠模型，随机将造模成功大鼠分为7组，每组10只，分别给予药物治疗和(或)运动训练，治疗6周后处死取材。观察各组大鼠心肌细胞的形态学变化、心肌中TH、NET含量、心肌组织中GAP-43基因及GAP-43蛋白表达变化。结果:心衰模型组TH、NET、GAP-43表达均明显升高，与假手术组比较差异有统计学意义;经药物和(或)运动训练干预后，与心衰模型组比较，各治疗组均明显下降，中药联合运动组效果最明显。结论:益气活血中药联合运动训练能减轻心肌间质及交感神经重塑，效果优于单纯的药物组及运动训练组。

慢性心力衰竭;酪氨酸羟化酶;去甲肾上腺素转运蛋白;生长相关蛋白-43

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是由多种原因引起的心肌结构和功能的变化，导致心室充盈和射血障碍而引起的一组临床综合征［1］。其发病机制较为复杂，而大多数学者普遍认为在HF发生发展过程中，心脏交感神经功能(cardiac sympathetic nerve function，CSNF)包括交感神经活性(sympathetic nerve activity，SNA)和/或再摄取功能(reuptake)变化与心肌间质重塑关系密切，但尚不能完全阐述两者之间的确切机制［2］。但可以肯定的是，进行性心室扩张、舒缩功能降低、心肌纤维化这一心肌间质重塑过程将最终导致CHF。因此，本课题小组通过建立CHF大鼠模型，选用益气活血复中药联合运动训练作为治疗手段，从CHF模型大鼠心肌 组 织 中 检 测 酪 氨 酸 羟 化 酶 (Tyrosine Hydroxylase，TH)、去甲肾上腺素转运蛋白(norepinephrine transporter，NET)及生长相关蛋白(growth associated protein 43，GAP-43)指标变化情况，探讨心脏交感神经再摄取功能蛋白膜表达与心肌间质重塑的关系及益气活血复方联合运动训练治疗CHF的作用机制，为CHF的治疗及康复提供科学依据和诊疗方案。

1 材料与方法

1.1 材料

益气活血复方由黄芪、人参、红花、丹参、益母草、三七粉、葶苈子等组成，按照相对密度为1.05～1.08进行煎煮、浓缩成汤液。赖诺普利片由上海信谊万象药业股份提供，每片 10 mg(国药准字H10960265)。以上所有药物均购自于辽宁中医药大学附属医院药剂科。

1.2 方法

1.2.1 慢性心衰大鼠模型塑造 3个月龄健康雄性SD大鼠(普通级)70只，体质量200～230 g，购于辽宁中医药大学动物实验中心，适应性喂养1周。采用冠脉结扎、配合力竭式游泳、减食等方法塑造CHF大鼠模型。4周后多普勒超声心动图检测，以左室射血分数小于60%作为心衰模型成功的标志，同时大鼠出现体质量减轻、精神萎靡、毛色无光泽列入观察对象。本次实验70只大鼠造模全部成功，将上述模型随机分成为假手术组、模型组、中药组、运动组、中药+运动组、西药组、西药+运动组7组各10只。除心衰模型组、假手术组给予常规等容积生理盐水灌胃外，其余各组于造模成功后给予药物治疗，各给药组大鼠运动训练与造模成功后1周进行，每次50 min，6周超声心动图检测后麻醉处死，摘取心脏组织－80℃保存待测。

1.2.2 病理学检测各组大鼠左室心肌细胞形态 将制备好的标本在10%福尔马林中固定，梯度酒精脱水，中性树胶封固，加盖玻片封固后，在显微镜下观察各组模型大鼠左室心肌细胞形态学改变情况。

1.2.3 免疫组织化学检测各组大鼠心肌组织中TH、NET含量 将制备好的标本常规固定、脱水、石蜡包埋，处理后放于60℃烤箱中烘烤30 min后，经梯度酒精脱水并蒸馏水洗，然后放入95℃微波炉加热10 min进行微波抗原热修复，冷却至室温加入1∶100稀释的一抗，4℃过夜，加入二抗，DAB显色。采用IPP6.0全自动图像分析系统处理结果，测量并计算染色图片免疫阳性点的累积光密度(IOD)和区域面积，随机选取10个视野计算出平均光密度值。

1.2.4 实时定量PCR各组大鼠心肌组织中GAP-43 mRNA表达 参照Trizol说明书采取一步法提取总RNA，紫外光分光光度计测定并计算总RNA浓度和纯度，RNA变性电泳并检验其变形程度，逆转录合成 cDNA，QPCR使用 Stratagene Mx3000p荧光定量PCR仪(Agilent Technologies提供)进行检测。使用 BrilliantⅢ Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix试剂盒，先以5倍梯度稀释的正常组cDNA为模板，分别以各引物完成定量PCR反应，测得各引物的扩增效率。再以各组样品cDNA为模板进行定量PCR检测，反应结束后由溶解曲线判断PCR反应的特异性。所得各样品Ct值结果利用公式得出各样品mRNA的相对表达量。

1.2.5 Western-blot法检测各组大鼠心肌组织中GAP-43蛋白表达 蛋白裂解液提取大鼠心肌组织中GAP-43的总蛋白，96孔酶标板法对蛋白定量，绘制标准曲线，并计算待测样品浓度及上样量。根据分离蛋白质的分子量室温下配制凝胶，待聚合后，电压150 V下行10%SDS-PAGE凝胶电泳分离;采用半干式转膜法进行蛋白转移;1∶1000稀释一抗，1∶2000稀释二抗;ECL法在暗室中进行X光胶片曝光，凝胶成像分析、记录蛋白电泳带灰度值并进行定量分析。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS 12.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，各组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义，P＞0.05为差异无统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠左室心肌细胞的形态学改变

图1显示，经HE染色后在40倍光镜下观察各组大鼠心肌细胞的形态学变化，结果发现假手术组大鼠心肌细胞排列规整，横纹清晰，大小、形态正常，肌纤维未见空白、断裂及缺损区;心衰模型组则见心肌细胞相互交织、核固缩，出现部分空白区，异染色质呈现团块状，相邻细胞闰盘间隙明显增宽，粒粒连接及紧密连接消失，肌原纤维排列紊乱、断裂及缺失;经中药、运动及西药干预各组大鼠心肌组织结构均呈心肌细胞排列比较有序，形态结构基本一致，肌纤维排列较规整，有部分断裂及缺损，偶有空白区等情况，中药联合运动组大鼠心肌细胞组织形态基本正常。

图1 HE染色各组慢性心衰大鼠心肌组织形态特征

2.2 各组大鼠心肌组织中TH、NET、GAP-43 mRNA、GAP-43蛋白表达

图2、3显示，染色均以心肌组织中点状、线状棕色染色为免疫阳性。与假手术组比较，模型组TH、NET、GAP-43 mRNA、GAP-43蛋白表达量增加，TH、NET平均光密度值均明显上调，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。表1图4显示，经药物和(或)运动训练干预后，各治疗组TH、NET、GAP-43 mRNA、GAP-43蛋白明显下降，与心衰模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，但中药联合运动组效果最明显，西药联合运动组次之，运动组则最差，中药组与西药组效果基本相同。

表1 各组大鼠心肌组织中TH、NET、GAP-43 mRNA、GAP-43蛋白表达水平(±s)

表1 各组大鼠心肌组织中TH、NET、GAP-43 mRNA、GAP-43蛋白表达水平(±s)

注:与假手术组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:#P＜0.05，##P＜0.01;与运动组比较:●P＜0.05，●●P＜0.01;与中药组比较:▲P＜0.05

组别 例数 TH(平均光密度) NET(平均光密度) GAP-43(ΔΔCT值) GAP-43(GAP-43/GAPDH)假 手 术 组 5 0.154±0.033# 0.289±0.011# 1.02±0.06## 0.313±0.052##模 型 组 5 0.331±0.019* 0.414±0.025* 2.31±0.27* 0.714±0.069中 药 组 5 0.247±0.011*# 0.209±0.019*#● 1.78±0.17＊＊## 0.544±0.054*##●西 药 组 5 0.226±0.012*#● 0.219±0.010*#● 1.65±0.29＊＊## 0.544±0.066*##●运 动 组 5 0.254±0.015*# 0.248±0.018*# 1.90±0.27*# 0.638±0.063*#中药 +运动组 5 0.200±0.015*#●●▲ 0.179±0.010*#●●▲ 1.40±0.21＊＊##●●▲ 0.466±0.043*##●●▲西药 +运动组 5 0.224±0.014*#● 0.250±0.010*#▲ 1.46±0.34＊＊##●●▲ 0.449±0.049*##●●▲

图2 各组模型大鼠心肌组织TH免疫组化检测结果

图3 各组模型大鼠心肌组织NET免疫组化检测结果

3 讨论

图4 各组大鼠心肌组织中GAP-43蛋白表达

慢性心衰(CHF)因其治疗棘手、致残及死亡率高，一直是困扰临床医生的重大问题。作为临床多种心血管疾病的终末期表现，对于CHF病理机制的研究及有效治疗方法，一直是国内外医学界长期探讨的热点问题之一［3］。研究发现，心衰发生时引起机体内源性神经内分泌系统激活，直接作用于心肌细胞，导致血流动力学异常改变。而作为交感神经“司令部”的心脏，亦通过去甲肾上腺素的释放及再摄取，发挥正性变传导、变力、变时作用［4］。压力荷状态下机体NET异常变化，一方面通过减少NE存储量，诱发心脏交感神经活性失调，心脏代偿反应功能降低;另一方面通过增加TH表达，引发I、III型胶原释放增高，心肌纤维化排列紊乱。而最终出现心脏反应钝化现象的原因，正是由于NET异常变化导致的NE水平持续增高，心肌收缩力不断增加，NET密度、功能或受体敏感等方面的异常，都将出现心肌增厚、细胞坏死或凋亡等形态学改变，激发HF进展、心功能持续恶化，并在一定程度上影响预后［5-6］。

心脏交感神经信号传递系统中重要的突触前调控环节的NET，在临床治疗CHF提供了一种新的诊疗模式——“阻滞神经体液因子和细胞因子激活”模式。与此同时，动物试验表明减少NET表达可改善HF动物模型的心功能［7］，亦佐证了交感神经再摄取功能对慢性心力衰竭的影响。本次研究结果表明，心衰状态下心脏交感神经重摄取功能下降，这将为心衰证的临床治疗提供又一重要证据。

而胞膜磷酸蛋白质-43(GAP-43)既调控生长锥的形成、附着、延伸和抵抗回缩，又决定神经发育、轴突再生、突触重建等生物活动的发生，因此将其作为研究神经生长发育和损伤修复等神经可塑性的首选分子探针［8］。研究表明，在缺氧缺血状态下，心肌内GAP-43异常表达对于增加心肌交感神经的分布、心肌细胞及组织的重塑具有决定性作用［9］。本次实验结果也表明，心衰状态下大鼠心肌组织中新生神经标志蛋白-GAP43无论是mRNA还是蛋白表达均同时增加，伴随检测的TH水平增高，验证了心脏交感神经密度增加的猜想。

CHF过程复杂，涉及面广，患者不仅存在心功能和形态的明显改变，活动能力和社会参与能力均显著下降，极大地影响了患者的生存质量。目前研究表明，运动训练已成为提高慢性心衰患者生存率及生存质量的重要形式［10］，以药物配合适当的有氧运动已成为CHF防治领域的趋势，即CHF的康复治疗。中药化学成分的多样性和生物活性的广泛性，为多环节、多靶点防治CHF提供了理论上的可行性，具有稳定性好、不良反应轻等特点。动物实验也发现，运动训练可以部分逆转神经激素系统的激活，运动训练后血清中 AngII水平下降，降低CHF状态下交感神经活动能力［11］。本课题组前期实验证明，益气活血中药联合运动训练能通过抑制MMP-1的表达，调节心肌组织中III型胶原蛋白的含量，增强心肌组织弹性，减轻心肌重构［12］。为进一步探讨慢性心衰心肌间质与交感神经重塑的机理，为中药联合运动训练防治心衰提供科学的依据。我们开展的本次实验研究证明，中药联合运动训练可能通过减少NET的表达，从而“阻滞神经体液因子和细胞因子激活”，抑制心脏交感神经的活性，降低心脏交感神经的密度，从而减轻心肌间质重构。

大量的实验表明，运动训练可以增加心输出量和局部血流［13］，运动训练可以增加患者骨骼肌血流［14-18］，而中医认为“气旺则血行”，“血行瘀消水散”。本实验正是采用“温阳益气、活血利水”之法，人参、黄芪益气温阳为君药，丹参、三七活血通脉为臣药，君臣合用共奏益气活血、气旺则血行之效;红花与益母草活血散瘀为佐药，葶苈子有泻肺逐水、强心之功，与黄芪配伍增强利水之功，全方益气以助气行、气行则血行各尽其责。由此是否可推测中药配合运动训练标本兼治、气旺则血行效果显著，其机理有待进一步的研究。

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Mechanism and Experimental Study of Chinese Joint Exercise Intervention Affected Myocardium of Rats with Chronic Heart Failure Quality and Sympathetic Remodeling

MA Jin1，ZHANG Yan2，ZHAO Shou-zhang1

(1.Liaoning Vocational College of Medicine，Shenyang 110101，China; 2.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China)

Objectives:Through the establishment of rat model of chronic heart failure，the use of yiqi Huoxue traditional Chinese medicine and sports training joint intervention to explore the mechanism of chronic heart failure，myocardial interstitial between sympathetic remodeling and new ways of prevention and treatment of chronic heart failure.Methods:In coronary artery ligation with formula swimming exhaustive，less food and other methods to shape the rat model of chronic heart failure，the successful model rats were randomly divided into seven groups of 10.After drug treatment were given and(or)exercise training for 6 weeks were sacrificed.observing the morphological changes in rat cardiomyocytes，myocardial TH，NET content of myocardial tissue GAP-43 GAP-43 gene and protein expression.Results A model group has TH，NET，GAP-43 expression was significantly increased compared with the sham group was statistically significant;after drugs and(or)exercise training intervention，heart failure model group than each treatment group were significantly decreased，TCM joint campaign group has the most obvious effect.Conclusion:Yiqihuoxue medicine combined with joint exercise training can reduce myocardial interstitial remodeling and sympathetic.The results are better than the drug group and exercise training group.

Chronic heart failure;Tyrosine hydroxylase;Norepinephrine transporter protein;Growth associated protein-43

R285.5

B

1006-3250(2016)11-1472-04

2016-05-21

辽宁省教育厅科学研究(L2012498)-慢性心衰大鼠心脏自主神经重构及益气活血复方联合运动训练的保护作用研究

马 金(1976-)，女，辽宁沈阳人，副教授，医学博士，从事康复医学的临床与研究。