六味地黄丸抗焦虑作用的实验研究*

陈 嵘，李 菊，谭丽萍，殷 华，朱晓松，汝 晶，杨杏芝，朱梦茹，季 恩

(1.云南中医学院基础医学院，昆明 650500;2.云南中医学院基础医学院实验中心，昆明 650500)

六味地黄丸抗焦虑作用的实验研究*

陈 嵘1，李 菊2，谭丽萍2，殷 华2，朱晓松1，汝 晶1，杨杏芝2，朱梦茹2，季 恩1

(1.云南中医学院基础医学院，昆明 650500;2.云南中医学院基础医学院实验中心，昆明 650500)

目的:观察六味地黄丸的抗焦虑作用。方法:采用改良天敌应激复制小鼠焦虑模型，与地西泮阳性对照组比较，观察高、中、低3个浓度的六味地黄丸对焦虑小鼠体质量、体温、饮水量、行为、血清γ-氨基丁酸(γ-amino-butylic，acid，GABA)水平的影响。结果:与空白组比较，模型组体质量减轻、体温升高，平均饮水量大，OE%、OT%、血清GABA浓度低;与模型组比较，其余各组体质量增加，阳性对照组体温降低，六味地黄丸高、中剂量组平均饮水量小且与阳性对照组的OE%、OT%、血清GABA浓度均较高;与六味低剂量组比较，高剂量组体温降低，平均饮水量小，OE%、OT%、血清GABA浓度高。结论:六味地黄丸滋肾阴而抗焦虑，具有量效依赖性，提高GABA水平是可能机制之一。

六味地黄丸;焦虑;γ-氨基丁酸;小鼠;实验

焦虑症(anxiety disorders)又称为焦虑性神经症，是以广泛和持续性焦虑或反复发作的惊恐不安为主要特征，常伴有自主神经紊乱及运动性不安的一种神经症，包括广泛型焦虑(GAD)和惊恐障碍(PD)［1］。其发病率逐年增高，目前全球范围达16.6%［2］，且45%的患者在发病2年甚至更长的时间内未得到及时有效的治疗［3］。临床应用六味地黄丸可缓解焦虑情绪［4-5］，故探讨其对焦虑小鼠的影响及其作用机制，可为临床辨证用药提供依据。

1 材料

1.1 动物

78只SPF级雄性昆明种小鼠由成都达硕生物科技有限公司提供(许可证号SCXK(川)2013-24)，体质量(30.20±1.38)g。

1.2 药物

六味地黄丸由云南中医学院第一附属医院中药房提供。药物组成:熟地黄24 g，山萸肉12 g，干山药12 g，泽泻9 g，牡丹皮9 g，茯苓9 g。中药浸泡30 min后常规水煎3次后过滤，经冷凝回流浓缩成稠浸膏，置4℃冰箱保存，临用前用蒸馏水配制成相应浓度。地西泮片2.5 mg/片，购自昆明医科大学第一附属医院精神科(上海信宜药厂有限公司，批号14141001B)。

1.3 主要仪器及试剂

TL-18M高速冷冻离心机(上海耐圣卡兰实业有限公司)、infiniteM200PRO酶标仪(Tecan公司)、BL-2200H电子天平(日本岛津公司)等。按文献［6］自制高架十字迷宫(the elevated plus-maze，EPM):两个相对的开放臂(open arm，内径:长×宽×高): 30 cm×5 cm×15 cm;两个相对的封闭臂(enclosed arm，内径:长×宽×高):30 cm×5 cm×0.5 cm;连接4只臂的中央平台(centre platform，内径，长 ×宽):5 cm×5 cm。其中2个相对闭臂上部是敞开的，4个臂及中央平台均为黑色，整体同定于铁质支架上，使迷宫底板到距实验室地面50 cm处。试剂盒:小鼠γ-氨基丁酸(γ-amino-butylic，acid，GABA) ELISA试剂盒(批号1052382，上海劲马实验设备有限公司)。

2 方法

2.1 动物分组

78只小鼠常规饲养6 d适应环境后，随机分为空白组、模型组、阳性对照组和六味地黄丸高、中、低剂量组。各组体质量、肛温实验前比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

2.2 模型复制与给药

依据中医学“恐伤肾”理论，参照文献复制天敌应激焦虑小鼠模型［7］:每天9∶00～11∶00AM，将除空白对照组外的各组小鼠单只放入13 cm×25 cm×25 cm铁丝笼，再置于50 cm×25 cm×30 cm猫笼内，将猫引入笼内自由活动60 min，但小鼠笼的铁丝网可阻止猫的攻击，小鼠可通过视觉、嗅觉及听觉体验到猫的存在，每天仅在应激实验结束后，猫进食1次，以保证第2天实验中的猫处于饥饿状态，维持其对小鼠固有的攻击性;45 min/次/d，持续7 d并录制猫的叫声和排泄物。从第7天开始改为猫叫声听觉刺激并排泄物嗅觉刺激，45 min/次/d，再持续7 d。

造模的同时，空白组、模型组给予蒸馏水20 ml· kg－1·d－1灌胃，六味地黄丸按高(1.35 g·kg－1· d－1)、中(0.45 g·kg－1·d－1)、低(0.15 g·kg－1·d－1)剂量，阳性对照组给予地西泮0.0003 g·kg－1·d－1配制成同等体积溶液灌胃，每日1次，于每天刺激结束后进行，持续14 d。

2.3 行为学测试与一般情况评定

高架十字迷宫正上方用支架固定数码摄像机，保证能够录制小鼠活动全视野。末次给药后次日(第15天)8∶00～11∶00AM安静环境中进行，每只小鼠先开场适应5 min;每次小鼠放入中央格前75%乙醇擦拭，消除前1只的气味和排泄物;放入时头朝封闭臂，观察者距离迷宫中央1 m以外，保持测试客观性。每只录制5 min，待全部结束后由2名实验人员观察录像，共同评定进入开放臂次数(open arm entry，OE)、进入开放臂时间(open arm time，OT)、进入封闭臂次数(close armentry，CE)、进入封闭臂时间(close arm time，CT)。计算入开臂次数百分比(OE%)=OE/(OE+CE)，入开臂停时间百分比(OT%)=OT/(OT+CT)，比值大则较少出现焦虑行为。体质量变化=实验后－实验前;饮水量以造模期平均量计算;体温(肛温)=实验后 －实验前。

2.4 标本采集与处理

EPM行为测试后各组小鼠摘眼球取血，于室温凝固2 h，1200rcf冷冻离心后迅速分离血清，按GABA试剂盒说明操作，上酶标仪450 nm波长测定OD值，绘制标准品线性回归曲线，根据其直线回归方程Y=0.1312X+0.2916(R2=0.9909)计算浓度。

2.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

表1显示，与空白组比较，模型组体质量减轻，体温升高，平均饮水量大，OE%、OT%、血清GABA浓度低;与模型组比较，其余各组体质量增加，阳性对照组体温降低，六味地黄丸高、中剂量组平均饮水量小且与阳性对照组OE%、OT%、血清GABA浓度均较高;与六味地黄丸低剂量组比较，高剂量组体温降低，平均饮水量小，OE%、OT%、血清GABA浓度高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组小鼠一般情况、焦虑行为与血清GABA浓度的比较(±s)

表1 各组小鼠一般情况、焦虑行为与血清GABA浓度的比较(±s)

注:与空白组比较:*P＜0.05;与模型组比较:#P＜0.05;与六味地黄丸低剂量组比较:ΔP＜0.05

组别浓度例数 体质量变化(g) 体温变化(℃) 饮水量(ml) OE% OT%一般情况 焦虑行为 GABA例数空 白 组 11 3.86±1.17 0.13±0.22 5.52±0.26 40.99± 3.8214.98±5.50 10 42.66±1.91模 型 组 10 －2.23±1.13* 0.48±0.15* 7.03±0.37*Δ 20.39± 4.83* 7.09±2.15* 9 29.89±2.07*阳性对照组 10 －1.10±1.65* －0.12±0.19# 5.53±0.26# 40.89± 5.39# 11.22±2.33Δ 9 40.03±2.74*#Δ六味高剂量组 10 0.84±1.29* 0.16±0.23# 5.66±0.32#Δ 41.92± 4.24#Δ 12.53±3.17#Δ 10 39.69±3.94#Δ六味中剂量组 11 0.37±1.69* 0.19±0.26# 5.80±0.31#Δ 36.14±11.13# 12.10±2.22# 9 36.89±1.81*#Δ六味低剂量组 10 1.32±1.73* 0.33±0.29 6.00±0.33Δ 21.33± 7.34# 7.66±2.37# 9 31.16±3.18*

4 讨论

研究结果显示，模型组小鼠体质量减轻，体温升高，平均饮水量明显增多，进入开放臂次数明显减少，说明天敌应激成功复制小鼠焦虑模型。焦虑症与心理应激导致神经-内分泌-免疫网络紊乱密切相关［8］，而抑制性神经递质GABA含量降低是其关键的病理机制。

心理应激致焦虑属于中医情志致病范畴，基本病机体现于肾-肝-心轴［9－10］。但既往研究多集中于心、肝，对肾的重视不足。《素问·阴阳应象大论》提出，肾在志为恐，恐则伤肾，且肾阴肾阳为全身阴阳之根。《类经图翼·大宝论》言:“五脏之阳非肾阳不能生，五脏之阴非肾阴不能滋”;《素问·生气通天论》更提出，阴者，藏精而起亟也;阴不胜其阳，则脉流薄疾，并乃狂。故天敌应激伤肾阴是情志导致焦虑的主要病机之一。

作为滋肾阴的经典名方，六味地黄丸中的熟地黄、山萸肉、山药三阴并补而制阳，阻抑肝阳上亢，故高、中剂量组延长焦虑小鼠进入高架十字迷宫开臂的时间，增加进入次数，利于紧张不安、恐惧、急躁易怒难于自制等精神症状的缓解;泽泻、牡丹皮、茯苓三泻，泻湿浊而降相火，防止津液损耗，故高、中剂量组饮水量减少;同时因补泻兼施而阴平阳秘，调节脾胃功能，使小鼠体质量增加，符合临床观察的结论［4、11］。目前认为，六味地黄丸调节神经-内分泌-免疫网络发挥抗衰老、改善学习、记忆功能的作用［12］，与降低血浆糖皮质激素(GC)水平、诱导海马神经突触的可塑性密切相关。据此推测，可能同时具有抗焦虑功能，因焦虑症下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能亢进，血浆糖皮质激素(GC)含量增加［8］。但目前尚未见其抗焦虑的实验报道，率先基于小鼠血清GABA含量探讨其抗焦虑效果，结果表明高剂量组与低剂量组比较差异显著，存在量效依赖性，初步揭示六味地黄丸不仅抗焦虑，且作用机制可能与提高GABA含量有关。但与HPA轴的关系、中枢作用机制、受体调控途径等尚不清楚，需进一步研究、阐明。

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Experimental Research on Anti-anxiety Effect of Liuwei Dihuang Pills

CHEN Rong1，LI Ju2，TAN Li-ping2，YIN Hua2，ZHU Xiao-song1，RU Jing1，YANG Xing-zhi2，ZHU Mei-ru2，JI En1

(Yun nan college of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China)

Objective:To observe the anti-anxiety effect of Liuwei Dihuang pills.Methods:The anxiety mice model of predator stress was treated with high，medium，and low concentrations of Liuwei Dihuang pills，compared with diazepam positive control group.And to detect the drug effect，the changes of experimental mice in body weight，temperature，amount of drinking water，behaviors，and the serum γ-GABA level were recorded.Results:The model group was compared with the control group，body weight decreased，body temperature increased，mean amount of drinking water increcsed，serum γ-GABA level，level of OE%and OT%was smaller;Compared with model group，the other groups were with rise of the body weight，body temperature reduced in positive control group，mean amount of drinking water was significantly less in high and medium dose group.For serum γ-GABA level，level of OE%and OT%，we found that control group，high or medium dose group was significantly higher than model group;Compared with low dose group，the body temperature reduced，mean amount of drinking water reduled，the serum γ-GABA level was higher，level of OE%and OT%was higher in high dose group.Conclusion:Nourishing yin recipe Liuwei Dihuang pills had anti-anxiety effect in a concentration effectdependent manner，and one probable mechanism was to up-regulate GABA expression level.

Liuwei Dihuang pills;Anxiety;γ-GABA;Mouse;Experiment

R749.7+2

B

1006-3250(2016)11-1476-03

2016-03-17礼·天官·疾医》中的“痒庎”用法同，不可训释为瘙痒，乃指痈疮、疮疥。

云南省教育厅科研基金项目(2014Y243)-滋肾阴方对焦虑小鼠血清GABA及HPA轴GR表达调控作用的研究

陈 嵘(1975-)，男，云南昆明人，副教授，医学学士，从事情志疾病的防治规律研究与临床心理治疗。

4.2 马王堆医籍“痒”字例

“痒”字于马王堆汉墓出土医籍一见。即《杂疗方》中:“□痒:羊头□□□□□□□□□暴(曝)干，令凝，以以(蜜)和之，大如□□□□□指端。”

学者多将此处“痒”字理解为瘙痒，“疑为女子阴痒之病”［19］，或云此方为“促进痒感方”［20］。马王堆汉墓出土医籍中“癢”字皆写作“養”或“ ”，“痒”字仅此处一见，不应是瘙痒之义，而是指疮疡。此方乃一种治疗疮疡的涂抹外用方。