电针大肠俞募穴对功能性便秘小鼠结肠内GDNFmRNA、RaimRNA表达影响的研究*

张 微，李 瑛，刘丽莎，罗芳丽，赵中亭

(成都中医药大学，成都 610072)

电针大肠俞募穴对功能性便秘小鼠结肠内GDNFmRNA、RaimRNA表达影响的研究*

张 微，李 瑛△，刘丽莎，罗芳丽，赵中亭

(成都中医药大学，成都 610072)

目的:探讨电针大肠俞募穴对功能性便秘小鼠结肠组织内GDNFmRNA、Rai mRNA表达的影响。方法:48只小鼠按随机数字表法分为对照组、模型组和电针组。采用复方地芬诺酯灌胃造模，电针刺激“天枢”、“大肠俞”后观察结肠上皮细胞形态、结肠组织内GDNFmRNA、Rai mRNA的表达情况。结果:模型组小鼠结肠上皮细胞凋亡增多，GDNFmRNA、RaimRNA表达降低。电针组结肠上皮细胞凋亡减少，GDNFmRNA、RaimRNA表达增强。结论:电针能改善功能性便秘小鼠结肠上皮细胞凋亡情况，上调GDNFmRNA、Rai mRNA的表达水平。

电针;俞募穴;功能性便秘;GDNFmRNA;RaimRNA

功能性便秘是临床常见病、多发病，以大便秘结不通、排便时间延长或欲便而艰涩不畅，或日久无便意为主要临床特征［1］，严重影响患者生活质量［2］。药物治疗易产生耐受性，且不良反应多，容易复发。临床研究结果证实，针灸治疗功能性便秘效果显著［3］，其中大肠俞配天枢这一经典的俞募配穴法，是针灸治疗该病最常用、最具特色的方法［4］。

肠神经胶质细胞(enteric glial cell，EGC)对维护肠神经系统的完整性、调节肠道内环境稳定发挥重要作用。EGC分泌的胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)可促进神经元存活，抗肠上皮细胞凋亡［5-6］，其与Rai结合激活PI3K-AKT信号通路，促进神经元增殖和存活，改善胃肠传输功能，可能是针刺治疗功能性便秘的重要作用机制。有研究表明，针刺可上调GDNF的表达水平。

因此，本研究以针刺俞募穴临床疗效确切的功能性便秘为研究对象，以功能性便秘小鼠模型为研究载体，从影响胃肠动力的重要因素GDNF、Rai入手，探讨大肠俞募配穴治疗功能性便秘的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF级昆明小鼠48只，体质量(30±5)g，购于成都达硕实验动物技术有限公司(动物生产许可证号scxk(川)2013-24)，适应性喂养3 d后开始实验。按照性别、体质量用随机数字表法将小鼠分为对照组16只、模型组16只、电针组16只。

1.2 主要仪器和试剂

1.2.1 主要仪器 转轮式切片机(德国徕卡);TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机(常州中威);PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州中威); BA200Digital数码三目摄像显微摄像系统(麦克奥迪);Image-Pro Plus 6.0图像分析系统(美国Media Cybernetics);SDZ-Ⅱ型华佗牌电针治疗仪(江苏苏州)。

1.2.2 主要试剂 复方地芬诺脂片(批号20130708，江苏常州);TUNEL试剂盒 (批号14590300，瑞士罗氏);原位杂交试剂盒(批号ISHD001，福州迈新);多聚甲醛(批号20130813，天津进丰);PBS磷酸盐缓冲液(批号ZLI-9062，北京中杉)。

1.3 动物造模

1.3.1 模型制备 针刺组、模型组小鼠均使用复方地芬诺酯混悬液以10 mg/kg·d的剂量进行灌胃，灌胃容量为0.1 ml/10 g，持续14 d;对照组小鼠给予0.9%生理盐水以相同剂量和容量进行灌胃，持续14 d［7］。

1.3.2 模型成功的判定标准 造模结束后动物禁食12 h，经口灌入浓度为100 g/L的活性炭悬液0.1 ml/10 g。从活性炭灌胃后开始计时，记录从灌胃到首粒黑便排出时间，以与对照组小鼠数据差异有统计学意义(P＜0.05)为判定模型成功的标准。

1.4 针刺方法

1.4.1 穴位选择与定位 选用大肠俞募配穴的2个腧穴“大肠俞”“天枢”，小鼠穴位定位及针刺深度均参照中国针灸学会实验针灸分会制定的《动物针灸穴位图谱》。天枢穴相当于小鼠脐中(腹部正中)旁开5 mm，大肠俞在腰部第4腰椎棘突下，旁开5 mm。

1.4.2 针具选择 针具选用汉医牌针灸针(天津华鸿医材有限公司生产)，Φ0.30×13 mm。

1.4.3 处理方法 电针组小鼠用特制固定板固定后，交替针刺同侧天枢和大肠俞，进针5 mm左右，捻转有紧滞感后针柄接电针仪。刺激参数:疏密波(疏波4 Hz，密波50 Hz)，以小鼠肢体末端轻微抖动为宜。留针30 min，每日1次［9］，5 d为1个疗程，疗程之间间隔2 d。对照组、模型组同法固定，但不接受任何治疗。每组动物分别接受1周、2周的治疗。

1.5 观察指标

1.5.1 小鼠排便情况 治疗结束后各组小鼠采用活性炭混悬液灌胃，小鼠称重后按照0.1 ml/ 10 g的剂量进行灌胃，记录从灌胃到首粒黑便排出时间。

1.5.2 结肠上皮细胞凋亡情况 利用TUNELPOD法检测针刺俞募穴对肠上皮细胞凋亡的影响。

1.5.3 GDNFmRNA及RaimRNA表达 用动物处死后所取样本，采用原位杂交结合计算机图像分析，检测远端结肠内GDNF mRNA及RaimRNA的表达。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，各组数据经过正态检验和方差齐性分析后，组间比较采用单因素方差分析，方差齐选用LSD(Least Significant Difference，最小显著差异法)，方差不齐选用Tamhane’s t2检验。

2 结果

2.1 小鼠排便情况

图2、3和表1显示，与对照组比较，模型组小鼠结肠组织GDNF mRNA、Rai mRNA含量均明显降低(P＜0.01);与模型组比较，电针组小鼠结肠组织GDNF mRNA、Rai mRNA含量升高(P＜0.05);各组内1周和2周比较含量变化均不明显。

表1显示，与对照组比较，模型组和电针组小鼠首粒黑便排出时间均延长(P＜0.01);与模型组比较，电针组小鼠首粒黑便排出时间均缩短(P＜0.01);而模型组和电针组组内1周、2周比较，首粒黑便排出时间差异不明显。

2.2 结肠上皮细胞凋亡情况

表1图1显示，与对照组比较，模型组小鼠结肠上皮细胞凋亡阳性表达率升高(P＜0.01);电针组比较，模型组凋亡细胞阳性表达率下降(P＜0.05);模型组和电针组组内1周、2周比较差异无统计学意义。

2.3 各组小鼠结肠组织中 GDNFmRNA、RaimRNA表达比较

表1 小鼠各检测指标表达情况(±s)

表1 小鼠各检测指标表达情况(±s)

注:与对照组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01

组 别 时间 首粒黑便排出时间(min) Rai mRNA积分光密度值对照组 1周 152.75±12.56 18.38±10.60 0.191±0.009 0.219凋亡细胞阳性表达率(%) GDNFmRNA积分光密度值±0.012 2周 151.75±11.81 22.88±18.83 0.191±0.006 0.218±0.007模型组 1周 313.88±14.59＊＊ 38.50±18.49＊＊ 0.174±0.007＊＊ 0.207±0.008 2周 309.38±19.18＊＊ 46.75±27.20＊＊ 0.173±0.008＊＊ 0.201±0.011＊＊电针组 1周 208.50±24.26＊＊△△ 25.00±11.69△ 0.184±0.0085△ 0.218±0.007 2周 205.38±22.32＊＊△△ 20.50±24.01△ 0.182±0.0055△ 0.210±0.010△

3 讨论

俞穴、募穴均属特定穴，是脏腑之气输注和汇聚的部位，临床主要用于治疗相关脏腑的病变。《素问·阴阳应象大论》曰:“从阴引阳，从阳引阴。”《难经·六十七难》亦载:“阴病行阳，阳病行阴。故令募在阴，俞在阳。”滑伯仁在《难经本义》中曰:“阴阳经络，气相交贯，脏腑腹背，气相通应。”脏腑之气通过气街与其相对应的俞募穴相联系，两者一前一后、一阴一阳共同发挥调节脏腑经络的虚实盛衰、平衡人体一身之气血阴阳的作用，因此临床上常将两者配合运用，以发挥其协同效应。在胃肠道疾病中，如功能性消化不良［9］、肠易激综合征［10］、便秘［11］等的临床治疗方案中，俞募配伍是临床最常用的配穴方法。有研究对近年来发表的针灸治疗便秘的临床文献进行分析［12］，使用频次最高的穴位为天枢、足三里和大肠俞，使用最多的配穴方法为俞募配穴。目前对针刺俞募穴治疗功能性便秘的机制研究主要集中在神经阶段分布上，并未从本质上阐释其作用机制。

肠神经系统(ENS)被称为“肠脑”，可分泌多种神经递质来调控胃肠功能，其功能异常被认为是便秘形成的主要原因之一。肠神经胶质细胞(EGC)是胃肠道感觉神经和交感神经的卫星细胞，具有维持肠神经系统以及调节神经活动的作用［13］。成熟的EGC可以产生GDNF，在肠神经的生长、分化及发育、损伤修复中起到重要作用［14-16］，其生物学效应由 GDNF家族受体1(GDNF family receptor 1，GFRα1)和络氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase，RET)介导。Rai是RET的生物底物，是原癌蛋白Shc家族中的一员，主要传递神经营养因子信号，维持神经细胞存活，抑制细胞凋亡。当神经细胞受GDNF浓度改变的刺激时，Rai的神经保护存活效应被激活，活化的受体可激活下游的磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphotydilinosital-3-kinase，PI3K)-Akt信号通路［17］。通过该途径，EGC可以维持ENS的完整性，改善胃肠动力。综上所述，GDNF、Rai在胃肠动力的生理病理机制中发挥着重要作用。另外有研究发现，针刺可以提高GDNF的表达水平及其作用效应［18-20］。

图1 各组小鼠结肠上皮细胞凋亡情况

图2 各组小鼠结肠GDNFmRNA原位杂交图片

图3 各组小鼠结肠Rai mRNA原位杂交图片

本实验中，我们应用最为经典的地芬诺酯灌胃法制作便秘小鼠模型，造模成功后进行1周和2周的电针刺激治疗。研究结果显示，功能性便秘模型小鼠首粒黑便排出时间延长，结肠上皮细胞凋亡明显，结肠组织内GDNFmRNA、RaimRNA表达降低。电针治疗能使功能性便秘模型小鼠结肠组织内GDNFmRNA、RaimRNA表达增强，进而抑制结肠上皮细胞凋亡，改善小鼠排便情况，提示电针改善功能性便秘小鼠的排便情况可能是通过调节GDNFmRNA、RaimRNA的表达水平来实现的。而电针治疗1周和2周之间各指标变化不明显，提示电针效应与疗程之间不呈正相关。

综上，本研究表明，电针刺激大肠俞募穴能提高GDNFmRNA、Rai mRNA的表达水平，改善功能性便秘小鼠结肠上皮细胞的凋亡情况。而对于GDNF的下游信号通路PI3K-AKT在电针治疗功能性便秘中的作用机制，我们在今后的研究中将进一步深入阐释。

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Effects of Electroacupuncture Back-shu and Front-mu Points on the GDNF-mRNA，RaimRNA Expression in Colonic Tissne for Mice of Functional Constipation

ZHANG Wei，LI Ying△，LIU Li-sha，LUO Fang-li，ZHAO Zhong-ting

(Chengdu University of TCM，Chengdu 610072，China)

Objective To explore the mechanism of electroacupuncture(EA)Back-shu and Front-mu points on GDNFmRNA，Rai mRNA in colon in functional constipation(FC)mice.Methods:48 mice were randomly divided into control group，model group，EA group.Using compound diphenoxylate orally modeling method and EA“Tianshu”，“Dachangshu”，the morphology of colonic epithelial structure，the level of GDNFmRNA，RaimRNA in colon were observed by TUNELand in situ hybridization.Results The expression of GDNF mRNA，，RaimRNA in model group was significantly decreased with more damage depithelial cells.EA back-Shu and front-Mu points can improve the expression of GDNF mRNA，RaimRNA.TUNEL found that acupuncture can repair damage depithelial cells.Conclusion:EA back-Shu and front-Mu points can up-regulate the expression of GDNF mRNA，RaimRNA in FC mice.

Electroacupuncture;Back-shu and Front-mu points;Functional constipation;GDNFmRNA;RaimRNA

R245.9+7

B

1006-3250(2016)11-1522-03

2016-05-17

国家自然科学基金面上项目(81273853)-针刺俞募穴治疗功能性便秘的EGC及ENS-ICC-SMC功能网络调整机制研究

张 微(1985-)，女，河北石家庄人，实验师，医学博士，从事针灸治疗肠神经系统疾病的效应及其机制研究。

△通讯作者:李 瑛(1964-)，女，四川人，教授，医学博士，从事针灸治疗消化系统疾病的效应及其机制研究，Tel:。