HPLC法同时测定参附注射液中五种人参皂苷的含量

曹丽梅，赵萱*，刘婷婷，唐敏，李茜，潘媛，傅超美

·炮制制剂·

HPLC法同时测定参附注射液中五种人参皂苷的含量

曹丽梅，赵萱*，刘婷婷，唐敏，李茜，潘媛，傅超美

目的：建立同时测定参附注射液中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd 5种主要皂苷成分含量测定高效液相色谱法。方法：采用Agilent ZORBAX SB-C18柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈（B）-水(A)二元梯度洗脱；在203 nm波长下进行含量测定。结果：表明人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd分别在31.72～158.60、11.43～57.15、129.87～649.35、117.30～586.50、18.71～93.55 μg·mL-1线性范围内线性关系良好（相关系数均大于0.995），平均加样回收率分别为98.28%、98.14%、99.40%、96.80%、98.63%。结论：同时测定参附注射液中上述5种成分，方法简便、准确、分离度好、重现性好，可用于参附注射液的质量控制；采用此种多成分、多指标评价中药注射剂的方法，更能体现产品的活性成分群及功能主治，控制产品有效性。

参附注射液；HPLC法；人参皂苷Rg1；人参皂苷Re；人参皂苷Rb1；人参皂苷Rc；人参皂苷Rd

自上个世纪30年代柴胡注射液首次问世以来，注射剂已经过八十多年的临床应用，取得了一系列令人瞩目的成绩，形成了“理论可靠、制剂有道、临床显效”的科学体系，尤其是中药注射液在治疗危、急重症及慢性疾病方面的特殊优势，使得中药注射液在现代中医药领域具有无可替代的地位。参附注射液源自七百年之古验方参附汤，是在中医药理论指导下，结合“整体活性、去杂存精”制剂原则和“直入血分、速效救急”临床应用的成功剂型改革典范。参附注射液临床应用剂量安全范围宽、毒副作用小，被广泛用于肺源性心力衰竭[1]、冠心病慢性心力衰竭[2]、充血性心力衰竭[3]、急性心力衰竭[4]的治疗，并取得了显著疗效。此外也抗休克[5]，对缺血再灌注损伤具有保护作用[6]。

中药注射剂具有多成分、多途径、多环节、多靶点的综合作用和整体效应。有学者采用“谱-效结合”方法研究参附注射液的化学成分，分离出于抗溶血作用有关的20种人参皂苷和6种乌头类生物碱，而目前多只以人参皂苷Rb1作为衡量制剂质量的指标[7]，难以体现中药复方注射液组方中“药有个性之特长，方有合群之妙用”的物质基础之“活性成分群”。另有文献报道谢华等采用高效液相法测定参附注射液中人参皂苷仅Rg1和Re两个成分的含量[8]。本试验选择参附注射液中5种主要皂苷类成分作为参附注射液中红参含量测定的指标成分，建立了快速同时测定5种皂苷成分的HPLC含量测定方法，对建立参附注射液更完善的质量控制体系有一定的科学的参考价值。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪（包括四元梯度泵单元、自动脱气单元、自动控温进样单元、DAD多波长检测器单元和Chem Station 色谱工作站等)。色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μm），美国Agilent Techologies 公司；CP225D型和BS210S型电子天平，德国Sartorius公司；KH—300DB型数控超声仪，昆山禾创超声仪器有限公司

1.2 试药

对照品人参皂苷Rg1（批号：MUST-16022407）、人参皂苷Re（MUST-16012701）、人参皂苷Rb1（MUST-16021907）购于成都曼斯特生物科技有限公司中国科学院成都生物研究所；对照品人参皂苷Rc（PS160414-05）、人参皂苷Rd（PS10051301）购于成都市普思生物科技有限公司，所有对照品经HPLC峰面积归一化法检测质量分数均在98%以上。乙腈为色谱纯，水为去离子水，其他试剂均为分析纯。参附注射液（批号：15110701004、150914010、150912010，10 ml/支）购于雅安三九药业股份有限公司。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱法测定参附注射液中5种有效成分含量

2.1.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相A为水，流动相B为乙腈，二元梯度洗脱程序为：0-25 min,20%-20%B；25-30 min,20%-30%B；30-45 min,30%-40%B；45-50 min,40%-19%B。体积流量1 mL·min-1；检测波长203 nm，柱温30 ℃，进样量10μL。对照品1、SF Injection 2色谱图。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd对照品适量，以甲醇溶解并定容，摇匀，制成适宜质量浓度的混合对照品溶液，置冰箱备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 取参附注射液适量，过0.22 μm的微孔滤膜，既得。

图A 对照品图谱 (t/min)

图B 参附注射液样品图谱 (t/min)1.人参皂苷Rg12. 人参皂苷 Re 3. 人参皂苷Rb1

2.1.4 系统适应性及专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液及SFI10 μL，按“2.1.1”项下方法进行检测，结果人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，拖尾因子均在在0.97～1.03范围内，理论塔板数以各色谱峰计算均在6000以上，方法专属性良好。

2.1.5 线性关系考察 分别精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd对照品适量，以甲醇溶解并定容，摇匀，配制成一系列不同质量浓度的5种混合对照品溶液。Rg1的质量浓度为31.72、63.44、95.16、126.88、158.60 μg·mL-1；Re的质量浓度为11.43、22.86、34.29、45.72、57.15 μg·mL-1；Rb1的质量浓度为129.87、259.74、389.61、519.48、649.35 μg·mL-1；Rc的质量浓度为117.30、234.60、351.90、469.20、586.50 μg·mL-1；Rd的质量浓度为18.71、37.42、56.13、74.84、93.55 μg·mL-1。按“2.1.1”项下色谱条件测定，进样量10 μL，记录色谱图。以峰面积积分值为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X）进行线性回归，得到回归方程、相关系数（γ）和线性范围，结果见表1。

表1 5种成分的回归方程和线性关系考察

2.1.6 精密度试验 取混合对照品溶液，连续进样6次，每次10 μl，按“2.1.1”项下方法进行检测，记录各组色谱峰峰面积。结果人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd峰面积的RSD分别为1.21%、1.26%、1.31%、1.19%、1.33%。

2.1.7 重复性试验 取同批次参附注射液，按2.1.3项下供试拼溶液的制备方法，制成6份供试品溶液，按“2.1.1”项下方法测定，计算各物质的质量浓度，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd的平均质量浓度分别为51.73、22.33、156.85、140.36、34.38 μg.mL-1，RSD分别为1.18%、1.47%、1.86%、1.59%、1.30%。

2.1.8 稳定性试验 参附注射液，室温放置，分别于制备后0、1、2、3、6、12、24 h注入高效液相色谱仪，按“2.1.1”项下方法测定，记录人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd的峰面积，RSD分别为0.42%、0.73%、0.23%、0.82%、0.51%；试验结果表明供试品溶液在24小时内稳定。

2.1.9 加样回收率试验 精密称取适量的对照品,甲醇溶解,定容,摇匀,制备成质量浓度与已测定参附注射液（批号：5110701001）相近的混合对照品溶液.分别精密量取0.12、0.20、0.28 mL的参附注射液与混合对照品溶液，制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算平均回收率。

表2 参附注射液的加样回收率试验结果(n=3)

2.2 参附注射液样品测定

取3批样品，分别制备供试品溶液，按“2.1.4”项下色谱条件进样，测定3次，记录各色谱峰的峰面积。计算3批参附注射液中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd五种皂苷的质量分数。结果见表3。

表 3 参附注射液中5种人参皂苷成分测定结果（n=3）

3 讨论

影响中药注射剂安全与有效性的因素很多，最主要的环节是注射剂的制备工艺，而中药注射剂的活性成分具有多成分，多靶点，多作用的特点，通过复方中多种有效成分的相互协调作用，发挥其更好的临床疗效。所以应尽可能选择多成分、多指标评价产品的质量，以保证参附注射剂的临床疗效。本试验首次建立HPLC同时测定参附注射液中Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd 5种主要人参皂苷含量的测定方法。试验过程中，还比较了202 nm波长和203 nm波长对皂苷含量的影响，结果表明5种皂苷均在203 nm处有最大吸收，受杂质的影响甚微，且基线平稳，准确度高。通过比较Agilent ZORBAX SB-C18柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μm）和Agilent Elispe XDS- C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），采用水-乙腈二元梯度洗脱，试验结果表明Agilent ZORBAX SB-C18柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μm）分离效果更好，分离时间短。

[1] 季文.参附注射液治疗肺源性心脏病心力衰竭的临床观察[J].山西医药杂志, 2004,33(1):79-80.

[2] 张志民.参附注射液治疗老年性冠心病慢性充血性心力衰竭30例[J].福建中医药,2003,34( 4):24-24.

[3] 贺抒，谢晓芳，张雪，等.附子水溶性物碱对心衰细胞模型的治疗作用[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(16):127-131.

[4] 李洪峰.参附注射液对急性心力衰竭患者血浆脑钠肽水平的影响[J].中国中医药科技,2011,18(4):347-348.

[5] 徐菲飞,彭成,王茁伉,谢晓芳.参附注射液对新生大鼠心肌细胞ATP酶及相关离子的影响[J].中药药理与临床2013,29(3):19-21.

[6] 麻日虎,李莹, 王玉璇.参附注射液后处理对肺缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国药物与临床, 2013, 13:437-439.

[7] 杨瑞杰.参附注射液化学成分研究[D].吉林大学化学学院硕士学位论文,2012.

[8] 谢华,王砚,刘仲义等.参附注射液中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量测定[J].华西药学杂志,2006,21(2):208-209.

(责任编辑：傅舒)

Simultaneous determination of fve components in School of pharnacy, Shenfu injection with HPLC method

/CAO Li-mei, ZHAO Xuan,LIU Ting-ting, TANG Min, LI Qian, PAN Yuan, FU Chao-mei //(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: To establish the method for simultaneous determination of ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, ginsenoside Rb1, ginsenoside Rc, ginsenoside Rd in Shenfu injection by HPLC. Method: Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150mm，5μm) column was used in detection with a gradient mobile phase system consisting of water and acetonitrile. The wavelength of DAD detector was set at 203nm for analytes detection. Result: The results shows that ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, ginsenoside Rb1, ginsenoside Rc, ginsenoside Rd have a good correlation among linear ranges of 31.72～158.60, 11.43～57.15, 129.87～649.35, 117.30～586.50, 18.71～93.55 μg·mL-1, respectively(γ＞0.9995). The average recovery was 98.28%, 98.14%, 99.40%, 96.80%, 98.63% respectively. Conclusion: This method can be used as a quantitative analysis for Shenfu Injection content determination.

Shenfu injection ; HPLC; ginsenoside Rg1; ginsenoside Re; ginsenoside Rb1; ginsenoside Rc; ginsenoside Rd

R285.5

A

1674-926X(2016)06-006-03

国家自然科学基金委青年基金项目编号（81503266）

成都中医药大学药学院，成都 611137;

曹丽梅（1991-），硕士研究生，从事中药新制剂、新技术与新工艺研究 Email:410501297@qq.com

赵萱（1986-），硕士，讲师，从事中药新制剂、新技术与新工艺研究 Email:626098860@qq.com

2016-05-10