人hnRNPA2/B1shRNA慢病毒载体的构建*

刘　瑶， 石　祥， 方　文*

(贵州医科大学 临床生化教研室， 贵州 贵阳　550004)

人hnRNPA2/B1shRNA慢病毒载体的构建*

刘瑶**， 石祥， 方文***

(贵州医科大学 临床生化教研室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 构建人核内不均一核糖核蛋白 A2/B1(hnRNPA2/B1)基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体。方法: 根据hnRNPA2/B1基因序列，设计4对hnRNPA2/B1 shRNA的干扰序列和1对阴性对照序列(NC-ShRNA)；合成靶序列双链DNA，与pGMLV-SC5RNAi慢病毒载体连接，通过测序鉴定阳性克隆；用构建的慢病毒表达载体和包装质粒共转染HEK293T细胞，荧光显微镜下观察转染病毒72 h后细胞中绿色荧光蛋白的表达，以验证共转染是否成功，超滤法浓缩病毒原液并测定病毒滴度。结果: 经酶切和BLAST对测序结果比对，重组克隆中插入的序列与设计合成的4对shRNA及1对阴性对照oligo DNA完全一致，提示慢病毒载体构建成功；荧光显微镜下，HEK 293T细胞可见强绿色荧光蛋白表达，慢病毒载体成功共转染入HEK 293T细胞，病毒滴度为5×1011TU/L。结论: 成功构建人hnRNPA2/B1基因shRNA 慢病毒载体，病毒滴度达5×1011TU/L。

[关键词]RNA干扰； 慢病毒； 293T细胞； 载体； 短发夹RNA； 核内不均一核糖核蛋白基因

目前，癌症的治疗主要以化疗为主，但由于肿瘤细胞耐药性的产生，导致肿瘤细胞对多数的化疗药物不敏感[1]。本课题组前期采用洛铂作用于宫颈癌细胞后，经双向电泳及质谱技术分析鉴定差异表达蛋白，发现核内不均一核糖核蛋白 A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1, hnRNPA2/B1)表达下调[2]。研究发现hnRNPA2/B1 基因参与了RNA的拼接、前体信使RNA(Pre-mRNA)的成熟和降解，端粒、端粒酶DNA序列的调节及细胞的增值、分化和凋亡等过程[3]，因此推测对hnRNPA2/B1基因的研究可有助于寻找治疗肿瘤的新靶点。本研究用含hnRNPA2/B1的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)与pGMLV-SC5RNAi慢病毒载体连接，构建含靶向hnRNPA2/B1 shRNA的重组慢病毒载体，为研究hnRNPA2/B1基因的作用及分子机制奠定基础。

1材料与方法

1.1主要材料及试剂

pGMLV-SC5RNAi慢病毒载体(含表达绿色荧光蛋白基因，上海吉满公司)、大肠杆菌菌株 DH5α(上海吉满公司)、HEK293T(中国科学院细胞库)、限制性内切酶BamH I、EcoR I和Taq polymerase

(NEB公司，美国)，Trizol 、Plasmid大抽Kit(QIAGEN公司，美国)，DMEM细胞培养基(Hyclone公司，美国)，胎牛血清(杭州四季青公司)，细胞培养瓶(Corning公司，美国)，0.25%胰蛋白酶(Gibco公司，美国)。

1.2方法

1.2.1shRNA靶点选择及引物的设计针对目的基因hnRNPA2/B1序列(GeneID 3181)，利用INVITROGENE公司提供的RNA干扰序列设计软件，设计多个RNA干扰靶点序列，根据NCBI BLAST 同源性分析，选择最佳的动力学参数的4个靶点ShNRA，同时随机选择1个阴性对照NC-shRNA(表1)，根据选择的基因序列分别设计并合成4对shRNA及1对阴性对照寡聚单链(oligo)DNA(表2)。

表1　hnRNPA2/B1 基因的4条特异性靶序列

表2　shRNA和NCshRNA序列

1.2.2ShRNA慢病毒重组质粒的构建吸取上下游引物10 μL放入PCR管内，95 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min、37 ℃ 2 min和25 ℃ 2 min进行退火。酶切体系为shRNA 5 μg、10×Buffer 5 μL、BamHI 2 μL和EcoRI 2 μL，用ddH2O补足至50 μL。37 ℃酶切30 min后进行电泳，电泳结束后，切下包含目的片段的胶条，回收载体。按照3 μL回收载体、Oligo引物1 μL、T4 DNA ligase buffer 1.5 μL和T4 DNA连接酶1 μL，用ddH2O补足体积至15 μL，于25 ℃水浴中孵育30 min，使shRNA载体与引物的连接。把连接产物全部加入感受态细胞中，于冰上放置20 min，后于42 ℃水浴中热击90 s。然后迅速置于冰上放置2～3 min。加入不含抗生素的LB培养基1 000 μL于37 ℃，150 r/min振荡培养45 min。3 000 r/min离心2 min，弃掉约850 μL的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有相应抗性的培养皿中，用灭菌的涂布器涂匀，倒置于37 ℃恒温培养箱内过夜培养。挑取单菌落，进行小量摇菌培养。测序鉴定阳性克隆。

1.2.3慢病毒包装将293T细胞置于含10% FBS的1640培养基的10 cm培养皿中生长，当细胞长到70%～80%时细胞换无血清培养基培养1～2 h后转染。取无菌1.5 mL EP管，加入DMEM培养基1 mL、shRNA 10 μg、 Lenti-HG Mix 10 μL和HG transgene reagent 60 μL，混匀后，室温放置15～20 min后均匀滴加到提前换过液的培养皿中共转染。共转染10～12 h时，均匀滴加100×Enhancing buffer(120 μL/平皿)促进转染。共转染18～20 h时换液，48 h后，吸取细胞上清液于50 mL离心管，4 ℃，4 500 r/min离心5 min；上清液用0.45 μm滤器过滤后转移到新的离心管中，最后将滤液分批转移到浓缩装置中，4 ℃，4 500 r/min离心10 min，此时滤器上层的液体即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液以50 μL/管进行分装， -80 ℃保存备用。

1.2.4病毒滴度的测定将HEK 293T细胞培养至对数生长期，细胞胰酶消化计数，按照8 000细胞/孔接种96孔板，37 ℃培养过夜；细胞长至30%～50%时进行转染，用含有10% FBS的细胞培养液以10为倍数进行病毒梯度稀释，选取所需的细胞孔，吸去培养基90 μL，取90 μL慢病毒稀释液加入每孔细胞中，放入37 ℃的细胞培养箱中培养。24 h后去除含慢病毒的培养基，加入完全培养基100 μL，48 h后在荧光显微镜下观察各孔中表达绿色荧光蛋白的细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细胞数×稀释倍数。

2结果

2.1pGMLV-SC5RNAi慢病毒载体构建及鉴定

构建的pGMLV-SC5RNAi慢病毒载体如图1。图2B中的泳道4为pGMLV-SC5RNAi慢病毒载体DNA经过BamHI和EcoRI酶切后，形成线性的DNA分子；而泳道2和3 均为未酶切的质粒DNA，可见环形和超螺旋的质粒DNA条带，泳道1、5为标准分子量参照物(marker)，电泳结果验证所提取的DNA 为pGMLV-SC5RNAi慢病毒载体DNA。测序结果经过BLAST软件比对，重组克隆中插入的序列与设计合成的4对shRNA及1对阴性对照oligo DNA完全一致(图2)，慢病毒载体构建成功。

注:A为pGMLV-SC5RNAi慢病毒载体模式，B为电泳结果图1　pGMLV-SC1 RNAi慢病毒载体模式及电泳结果Fig.1　Map of pGMLV-SC1 RNAi lentiviral vector

图2　慢病毒干扰载体中oligo DNA测序Fig.2　Map of Sequence lentiviral interfered vector

2.2慢病毒载体的包装及滴度测定

hnRNPA2/B1-shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4及NC-shRNA病毒感染HEK 293T细胞，荧光显微镜下可见细胞生长良好，细胞内可见强的绿色荧光(图4)，说明慢病毒载体包装成功，在含有10×10-5个/L细胞浓度的慢病毒液孔中观察到表达绿色荧光蛋白的细胞数均>50。病毒的滴度为5×1011TU/L。

3讨论

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是导入一条RNA序列，此序列与目的基因的mRNA序列同源，因此可以将目的基因的mRNA有效的特异降解，使目的基因失去应有的功能[4]。目前, RNA干扰的方法最常用的是直接转染 siRNA 和构建shRNA 载体。在感染的细胞中，shRNA 序列能够被加工成需要的 siRNA，并稳定地传到子代细胞中发挥作用[5-6]。RNA干扰技术现已在肿瘤发生、发展转移及肿瘤的耐药广泛应用[7-8]。有研究表明利用RNA干扰技术干扰基因的表达后，会增加列腺癌细胞、头颈部鳞癌、胰腺癌细胞等对抗癌药物的敏感性[9-13]。课题组前期用洛铂处理宫颈癌Caski细胞，经双向电泳及质谱技术分析鉴定差异表达蛋白，发现hnRNPA2/B1表达下调[2]。hnRNPA2/B1基因能参与RNA的一系列生理活动和对端粒以及端粒酶的调节，同时对细胞的分化和凋亡也起到一定作用[3]。特别是对端粒酶的影响非常重要，参与了肿瘤细胞的凋亡[14]，hnRNPA2/B1是一种原癌基因，有研究证实hnRNPA2/B1基因在多种癌症中均高表达，干扰hnRNPA2/B1会增加抗癌药物对胰腺癌细胞的敏感性，hnRNPA2/B1的表达降低,抑制肿瘤形成[15-16]。利用慢病毒构建的shRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞，悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达[17]。本研究用含hnRNPA2/B1的shRNA与pGMLV-SC5RNAi慢病毒载体连接，构建含靶向hnRNPA2/B1 shRNA的重组慢病毒载体，期望为研究hnRNPA2/B1基因的作用及分子机制奠定基础。本研究设计的4个靶点ShNRA及1个阴性对照oligo DNA经过测序并经BLAST对比证实了插入慢病毒中的干扰序列的方向和序列。将构建的慢病毒载体和包装质粒共同转染HEK 293T细胞，成功并且获得高浓度的病毒颗粒。

综上，本研究成功构建高浓度的hnRNPA2/B1 shRNA 慢病毒载体，为研究hnRNPA2/B1基因的作用及分子机制奠定基础。

注:A为shRNA1，B为shRNA2，C为shRNA3，D为shRNA4及E为NC-shRNA图3　慢病毒shRNA感染的HEK 293T细胞中绿色荧光蛋白表达Fig.3　Fluorescence photos of the HEK 293T cells infected by shRNA lentiviral

4参考文献

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(2016-03-28收稿，2016-05-19修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 刘华

Construction and Identification of Lentivirus Vector of shRNA for Human hnRNPA2/B1 Gene

LIU Yao, SHI Xiang, FANG Wen

(DepartmentofClinicalBiochemistry,GuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To construct lentivirus vector of shRNA for human hnRNPA2/B1 gene. Methods: According to the sequence of hnRNPA2/B1 gene, 4 pairs of interference sequence containing hnRNPA2/B1 shRNA and 1 pairs of interference sequence containing negative control were designed. Targeted double chain DNA was synthesized and connected to the lentivirus vector. Positive clones were identified by sequencing. The constructed vector of slow virus expression vector and packaging plasmids were co-transfected to HEK293T cells. The expression of green fluorescent protein was observed under fluorescence microscope 72 h after virus transfection in order to verify whether co-transfection was successful or not. Ultrafiltration concentrated virus solution and the virus titer was determined. Results: Comparison of the results of enzyme digestion and blast sequencing showed that the insertion sequence of the recombinant clones was completely consistent with 4 pairs of shRNA and 1 pair negative control DNA oligo, indicating that the Lentivirus vector containing shRNA hnRNPA2/B1 was successfully constructed. Under the fluorescence microscope, the 293T HEK cells showed strong green fluorescent protein expression, indicating that the slow virus vector was successfully co-transfected into 293T HEK cells. The virus titer was 5×1011tu/L. Conclusions: Lentivirus vector of shRNA for human hnRNPA2/B1 gene is successfully constructed, and the virus titer is 5×1011tu/L.

[Key words]RNA interference; lentivirus; 293T cells; vector; Short hairpin RNA; heterogeneous nuclear ribosomal protein gene

*[基金项目]国家自然科学基金(81560481)

[中图分类号]Q782

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)06-0630-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.003

**贵州医科大学2013级硕士研究生

***通信作者 E-mail:281123997@qq.com

网络出版时间：2016-06-16网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1648.024.html