有氧、乏氧环境下齐墩果酸对肿瘤细胞的放射增敏作用

杜希剑, 余开湖, 章凯敏, 何　立

(1.武汉大学基础医学院, 湖北 武汉, 430071;2.咸宁市中心医院 同济咸宁医院 湖北科技学院附属第一医院 介入中心, 湖北 咸宁, 437000)



有氧、乏氧环境下齐墩果酸对肿瘤细胞的放射增敏作用

杜希剑1, 2, 余开湖2, 章凯敏2, 何立1

(1.武汉大学基础医学院, 湖北 武汉, 430071;2.咸宁市中心医院 同济咸宁医院 湖北科技学院附属第一医院 介入中心, 湖北 咸宁, 437000)

摘要:目的观察有氧、乏氧环境下齐墩果酸(OA)的放射增敏作用。方法以人 A549 肺腺癌细胞为实验对象，进行有氧和乏氧处理，观察OA对有氧、乏氧状态下A549 细胞的放射增敏作用。采用MTT法确定有氧、乏氧环境下OA 半数有效抑制浓度(IC50)。使用多靶单击模型拟合细胞集落生成实验中A549细胞存活曲线，计算出细胞的放射增敏比(SER)。结果有氧组A549细胞的IC50浓度为29 μg/mL，乏氧组IC50浓度为78 μg/mL，分别采用50%IC50、IC50两种浓度对A549 细胞进行处理，处于有氧、乏氧环境下，IR(单纯照射)+50%IC50处理的A549细胞SER显著低于IR+IC50处理的A549细胞的SER(P<0.05)。有氧环境下IR+50%IC50处理的A549细胞的SER显著高于乏氧环境下IR+IC50处理的A549细胞的SER(P<0.05)。结论在有氧和乏氧环境下，OA都能明显上调肿瘤细胞的放射增敏作用。

关键词:齐墩果酸; 恶性肿瘤; 放射增敏

放射治疗是一种局部杀伤肿瘤细胞的治疗方法，其疗效取决于肿瘤组织、器官对于放射敏感性，一般增殖活跃、分化程度高的肿瘤细胞放射敏感性较高[1]。此外肿瘤细胞中的氧含量也能影响放疗的治疗效果。有研究[2]发现，肿瘤组织中的乏氧细胞对放射线的耐受性是有氧细胞的

2.5～4倍，放射敏感性明显降低，直接限制了放射治疗的效果。对于放射敏感性低的肿瘤患者的治疗，临床上常使用放射增敏剂来提高放射治疗的效果，改善患者的预后[3]。近年来发现，放射增敏剂主要分为亲电子化合物、DNA修复抑制剂、生物还原活性物、巯基抑制剂及氧利用抑制剂5种[4]，可以通过不同的机制加强肿瘤细胞放射性损伤，降低患者肿瘤的转移与复发。齐墩果酸(OA)是一种从天然植物中提取的化合物，具有抑制肿瘤血管生成，促进肿瘤细胞凋亡的效果[5-7]。近年来有学者[8-9]指出，齐墩果酸也具有增加放射治疗的敏感性的作用。本文主要观察有氧、乏氧环境下齐墩果酸对肿瘤细胞的放射增敏作用的影响，现报告如下。

1材料与方法

1.1细胞培养及预处理

A549细胞(人A549 肺腺癌细胞株)采用含 10% 胎牛血清的 RPMI Medium 1640培养基培养，分装入25 mL的培养瓶中，细胞密度至2×105个/mL活细胞，置 37 ℃恒温培养箱中，继续培养。每3～4 d传代 1 次，达一定数目后进行后续各项实验。

A549细胞置于CoCl2模拟乏氧环境下，采用100 μmol/L CoCl2预处理 4 h, 且在后续实验的过程中保证培养基终浓度始终为100 μmol/L。NAC 预处理是指在用齐墩果酸处理肿瘤细胞之前，先用5 mmol/L的NAC预处理24 h。

1.2实验方法及观察指标

1.2.1有氧、乏氧环境下齐墩果酸半数有效抑制浓度(IC50)测定：取A549对数期生长细胞，接种于96孔板中，毎孔5 000个细胞(200 μL)设置3个实验组和阴性对照组，当细胞贴壁生长时，分别用 125、62.5、31.2、7.8、3.9 μg/mL的 OA 处理(上海微蒙生物科技有限公司出品，纯度 99%)，培养24 h后加入RPMI Medium 1640培养基和MTT溶液(9∶1)继续培养4 h，测定光吸收值，得出实验组和阴性对照组细胞抑制率。以齐墩果酸浓度梯度为横坐标，以细胞生存率为纵坐标，分别做出有氧和乏氧环境下齐墩果酸给药浓度与细胞生存曲线，计算得出齐墩果酸半数有效抑制浓度(IC50)。

1.2.2有氧、乏氧环境下齐墩果酸对A549细胞的放射增敏作用：2组研究对象分别给予单纯射线照射(IR)、IR+50% IC50和IR+IC50共3种方法进行处理，细胞培养在60 mm 培养皿中，进行 X 射线照射，源靶距为100 cm, 剂量率 250 cGy/min，照射野根据培养瓶或培养皿个数而定，照射剂量设定为 0、1、2、3、5、7 Gy。固定染色后测定细胞集落数，重复试验3次，取其平均值，计算生存分数(SF)，使用多靶单击模型拟合细胞存活曲线，计算平均致死量(D0)、准阈剂量(Dq)及放射增敏比(SER)。

1.3统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1有氧、乏氧环境下不同齐墩果酸给药浓度对A549细胞生存情况的影响

通过分析有氧和乏氧环境下齐墩果酸给药浓度与细胞生存曲线发现，在有氧环境下，当齐墩果酸给药浓度达到15.6 μg/mL时，细胞生存率明显下降，且随着齐墩果酸给药浓度的提高，A549细胞生存率呈现下降的趋势(P<0.05)。有氧组A549细胞的IC50浓度为29 μg/mL, 在乏氧组IC50浓度为78 μg/mL。见图1。

与对照组比较,*P<0.05,▼P<0.05

2.2有氧、乏氧环境下齐墩果酸对A549细胞的放射增敏作用比较

使用50% IC50和IC50两种浓度的齐墩果酸对有氧、乏氧环境下A549细胞预处理24 h后，待细胞增殖呈集落后进行染色计数。带入多靶单击模型进行数据拟合后发现，随着放射剂量的增加，细胞存活分数(SF)降低，通过比较后发现，当放射剂量大于2 Gy时，有氧、乏氧环境下经IR+IC50及IR+IC50处理A549细胞SF明显低于单纯照射组(IR)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。比较有氧、乏氧环境下齐墩果酸对A549细胞的放射增敏比(SER)发现，处于有氧、乏氧环境下，IR+50% IC50处理的A549细胞SER明显低于IR+IC50处理的A549细胞的SER，差异均有统计学意义(P<0.05)。组间比较发现，有氧环境下IR+50%IC50处理的A549细胞的SER显著高于乏氧环境下IR+IC50处理的A549细胞的SER(P<0.05)。见表1、图3。

A为有氧组，B为乏氧组

图3 齐墩果酸对有氧、乏氧环境下A549细胞的放射增敏比的影响(▼P<0.05)

表1　单击多靶模型拟合细胞存活曲线下相关生物学指标比较

3讨论

放射增敏剂是指与放射线共同使用才提高射线杀伤肿瘤细胞作用的一类药物，其单独使用不杀伤细胞[10]。近年来研究[11]发现，影响肿瘤放射敏感性的因素主要与肿瘤组织中乏氧细胞的数量、谷胱甘肽的含量、细胞放射损伤的修复能力、细胞周期、再氧合作用、射线照射的剂量等因素有关。放射增敏剂可以使肿瘤细胞DNA靶分子自由基夺取电子，增加DNA碱基氧化与吸电子还原修复的能力[12]，此外还可以使细胞内的巯基化合物细胞修复损伤能力受到抑制，达到提高放射敏感性的作用[13]。

齐墩果酸广泛存在自然界植物中，主要以游离或苷化物的形式存在，临床上可起到护肝、解毒、降血糖血脂、抗炎抗病毒、抗过氧化作用、抗癌、抗突变等作用[14]。有文献[15-16]指出，齐墩果酸可以直接抑制肿瘤生长，降低放射治疗对造血组织的损伤，具有抑制肿瘤细胞的侵袭、增殖，促进细胞凋亡及抑制血管新生等作用，可对多种肿瘤细胞起作用，可为肿瘤的治疗提供一种新的药物选择。本研究发现，通过分析有氧和乏氧环境下齐墩果酸给药浓度与细胞生存曲线发现，在有氧环境下，当齐墩果酸给药浓度达到15.6 μg/mL时细胞生存率明显下降，且随着齐墩果酸给药浓度的提高，A549细胞生存率呈现下降的趋势(P<0.05)。有氧环境下A549细胞的IC50浓度为29 μg/mL，在乏氧环境下IC50浓度为78 μg/mL，表明齐墩果酸可以有效抑制肿瘤增殖，随着药物浓度的增加，肿瘤细胞生存率降低，有氧环境下较乏氧环境下半数有效抑制浓度(IC50)降低，提示齐墩果酸在有氧环境下对人肺腺癌细胞细胞毒性较强，具有明显抑制肿瘤生长的作用，而在乏氧环境下细胞毒性较弱。

对于齐墩果酸放射增敏机制主要和调节细胞周期中调控因子紊乱、诱导细胞凋亡相关[17]，有研究[18]报道，低浓度的齐墩果酸可以抑制G2M期Jurkat细胞增殖，而高浓度的齐墩果酸则杀伤G0/G1期Jurkat细胞。齐墩果酸可以通过恢复调控因子的功能达到修复受损细胞、抑制肿瘤的作用[19]。齐墩果酸还能激活凋亡蛋白Bax，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，影响线粒体结构和功能，合成凋亡小体，上调Caspase-9的表达，使得肿瘤细胞DNA断裂促使细胞凋亡的发生[6，20]。

本研究发现，使用50%IC50和IC50两种浓度的齐墩果酸对有氧、乏氧环境下A549细胞预处理24 h后，待细胞增殖呈集落后进行染色计数。带入多靶单击模型进行数据拟合后发现，随着放射剂量的增加，细胞存活分数(SF)降低。通过比较后发现，当放射剂量大于2 Gy时，有氧、乏氧环境下经IR+IC50及IR+IC50处理A549细胞SF显著低于单纯照射组(IR)。

比较有氧、乏氧环境下齐墩果酸对A549细胞的放射增敏比(SER)发现，处于有氧、乏氧环境下，IR+50%IC50处理的A549细胞SER明显低于IR+IC50处理的A549细胞的SER，差异均有统计学意义(P<0.05)。组间比较发现，有氧环境下IR+50%IC50处理的A549细胞的SER显著高于乏氧环境下IR+IC50处理的A549细胞的SER(P<0.05)。说明在有氧和乏氧环境下，随着齐墩果酸浓度的上升，肿瘤细胞放射增敏作用加强。当齐墩果酸浓度达到IC50时，乏氧环境下肿瘤细胞放射敏感性低于有氧环境下肿瘤细胞。当给予齐墩果酸浓度50%IC50时，二者无显著差异。这可能与肿瘤细胞接受放射治疗后，肿瘤周边组织对于放射敏感的细胞优先死亡，大剂量的齐墩果酸可加强乏氧细胞与血管氧交换的功能，乏氧细胞向有氧细胞转化程度加大，亦可上调放射增敏作用[21]。

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收稿日期:2016-04-01

基金项目:湖北省卫计委科研基金项目(WJ2015MB232)

通信作者:章凯敏, E-mail: 1470708440@qq.com

中图分类号:R 734

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)13-040-04

DOI:10.7619/jcmp.201613012

Radiosensitizing effect of oleanolic acid on tumor cells in aerobic and anoxic environments

DU Xijian1, 2, YU Kaihu2, ZHANG Kaimin2, HE Li1

(1.BasicMedicalCollegeofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei, 430071; 2.InterventionalCenter,XianningCentralHospital,TongjiXianningHospital,TheFirstAffiliatedHospitalofHubeiUniversityofScienceandTechnology,Xianning,Hubei, 437000)

ABSTRACT:Objective: To explore the radiosensitizing effect of oleanolic acid (OA) in aerobic and anoxic environments.MethodsHuman A549 lung adenocarcinoma cells were treated with oxygen and hypoxic culture, and the effects of OA on A549 cells were observed.MTT method was used to determine the median effective inhibitory concentration (IC50) of OA under aerobic and anoxic conditions.Cell survival curves were fitted by using a multi target click model to describe the A549 cell survival curve, and the radiation enhancement ratio (SER) was calculated.ResultsThe IC50 concentration of A549 cells in the aerobic group was 29 μg/mL, and the concentration of IC50 in the hypoxia group was 78 μg/mL.50% IC50 and IC50 concentrations were used to process A549 in oxygen and hypoxic oxygen conditions.SER of A549 cell processed with IR (irradiation) +50% IC50 was significantly lower than that of A549 cells processed with IR+IC50 treatment of (P<0.05).SER of A549 cells processed with IR+50%IC50 in the aerobic environment was significantly higher than that processed with IR+IC50 in hypoxic conditions (P<0.05).ConclusionOA can significantly up-regulate the radiation sensitivity of tumor cells in aerobic and hypoxic environments.

KEYWORDS:oleanolic acid; malignant tumor; radiosensitizing effect