葛根素对成骨细胞增殖、分化及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响

王晓晖，罗向霞，史晓伟，张定华

甘肃省中医院内分泌科，甘肃 兰州 730050

葛根素对成骨细胞增殖、分化及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响

王晓晖，罗向霞，史晓伟，张定华

甘肃省中医院内分泌科，甘肃 兰州 730050

目的：探讨葛根素（Pue）对高糖培养的成骨细胞增殖、分化及Ⅰ型胶原mRNA（CollⅠmRNA）表达的影响，为临床治疗糖尿病骨质疏松症提供实验依据。方法：取出生24 h内的SD大鼠的颅骨，体外分离培养成骨细胞，待细胞形态稳定后，取对数生长期的成骨细胞，随机分为正常组、高糖组（葡萄糖浓度22 mmol/L）、葛根素各浓度组（葛根素浓度分别为10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L）、高糖加葛根素各浓度组，每组设8个复孔，分别培养48 h，隔天换液并加药。测定成骨细胞的增殖能力、细胞内ALP活性以及CollⅠmRNA表达情况。结果：与正常组比较，葛根素各浓度组细胞增殖、细胞ALP活性、细胞CollⅠmRNA表达均显著增高，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；高糖组、高糖+葛根素各浓度组明显低于正常组，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。与高糖组比较，高糖+葛根素各浓度组细胞增殖、细胞ALP活性、细胞CollⅠmRNA表达均显著增高，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。结论：高糖情况下抑制成骨细胞的增殖、分化和Ⅰ型胶原表达，但加入葛根素后能提高成骨细胞的增殖、分化和Ⅰ型胶原表达，说明葛根素对糖尿病骨质疏松症有治疗作用。

葛根素；成骨细胞；增殖；分化；Ⅰ型胶原；新生SD大鼠；细胞实验

目前全世界大约有2亿人患骨质疏松症，在继发性骨质疏松症中，内分泌性骨质疏松症是重要的类型[1]。糖尿病性骨质 疏 松 症 (Diabeticosteoporosis， DOP)是 指 糖 尿 病(diabetesmellitus，DM)患者并发骨量减少和骨组织的显微结构遭到破坏，骨脆性增加，容易发生骨折的一种全身代谢性骨病，是DM发生在骨骼系统的慢性并发症[2]，目前尚无有效治疗方案。研究发现，葛根中含有多种异黄酮成分，包括葛根素(Puerarin，Pue)、大豆苷和大豆黄酮等，这些成分有明显的降糖、降脂作用[3]，同时改善患者骨质代谢，对于骨质疏松有明显的防治作用。临床观察表明葛根素可明显减轻糖尿病骨质疏松症状[4]，但其治疗制未明。为此，本研究拟通过培养成骨细胞，添加不同浓度葛根素，观察其对高糖环境下成骨细胞的增殖、分化及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响，研究其可能的作用机制。

1　实验材料

1.1实验动物新生24 h的SD大鼠10只(甘肃省中医药大学动物实验室提供，合格证编号：2014315)。

1.2实验仪器CO2恒温培养箱(美国Thermo公司)，超净工作台(中国杭州净化设备厂)，GeneAmp全自动PCR仪(美国ABI公司)，酶标仪(日本Bio-RAD Model 550)，细胞培养瓶及培养板(美国Costar公司)，紫外分光光度仪(上海天美仪器公司)，CK-40型OLYMPUS倒置光相差显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.3实验试剂葛根素(中国药品生物制品检定所)，MEM干粉培养基(GIBCO公司)，小牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶(上海华美公司)，四甲基偶氮唑盐(美国Sigma公司)，对硝基苯磷酸二钠盐(南京建成生物工程研究所)，PCR引物(大连宝生物生物工程有限公司)，逆转录聚合酶链反应试剂盒(大连宝生物生物工程有限公司两步法试剂盒DRR014A)，RNA提取试剂盒RNAiso Reagent(大连宝生物生物工程有限公司两步法试剂盒D312)。

2　实验方法

2.1成骨细胞的培养取出生24 h内的SD大鼠的颅骨，彻底剥离骨膜等软组织，置入含DMEM培养液的培养皿中，修剪成1～3 mm3大小的骨片，加入胰酶在37℃环境下振荡消化2～3 min，再加入等体积的含15%胎牛血清DMEM终止消化。吹打细胞，收集消化液，在4℃，1000 r/min条件下离心10 min使细胞沉淀。沉淀细胞放置于含15%胎牛血清DMEM培养基(含青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL)的培养皿内，并以约5×104/cm2的密度接种于培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱内培养，每2～3天换液1次。

2.2形态学观察培养48 h后将贴壁细胞用4%多聚甲醛固定，然后PBS洗涤3次，常规HE染色，在显微镜下观察成骨细胞形态。同时按比例配制BCIP/NBT染色工作液，48孔板每孔加100 μL上述BCIP/NBT染色液，室温避光孵育5～30 min，直至显色至预期深浅，去除工作液，用蒸馏水洗涤终止显色。在倒置显微镜下，计数每孔成骨细胞样细胞数，并计数细胞ALP染色阳性率。

2.3细胞的分组及给药待细胞形态稳定后，取对数生长期的成骨细胞，每孔200 uL加入96孔细胞培养板中。随机分为正常组、高糖组(葡萄糖浓度22 mmol/L)、葛根素各浓度组(葛根素浓度分别为10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)、高糖加葛根素各浓度组，每组设8个复孔，分别培养48 h，隔天换液并加药。

2.4MTT法检测成骨细胞增殖能力细胞传至第1代用0.25%的胰蛋白酶和0.02%EDTA消化计数后，用含10%小牛血清MEM培养基以2×103/孔密度接种于96孔板内，37℃，5%CO2培养箱中培养，24 h后镜下观察细胞贴壁稳定后，去掉上清液进行细胞分组及给药72 h后，用MTT法分析细胞增殖情况，结果以酶联免疫检测仪在490 nm波长处读取酶活性测得OD值表示。

2.5PNPP法检测成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）活性细胞的培养及给药方法同2.4，给药结束后，用对硝基苯酚磷酸二钠(PNPP)法分析细胞内碱性磷酸酶活性情况，结果以酶标仪在405 nm波长处读取酶活性测得OD值表示。

2.6RT-PCR方法检测成骨细胞Ⅰ型胶原mRNA（CollⅠmRNA） 的表达细胞传至第1代用0.25%的胰蛋白酶和0.02%EDTA消化计数后，用含10%小牛血清MEM培养基以5×104/孔密度以每瓶5 mL加入100 mL培养瓶，37℃，5% CO2培养箱中培养，24 h后镜下观察细胞贴壁稳定后再培养10天，去掉上清液，加入Trizol试剂提取总RNA，37℃反转录反应15 min，85℃反转录酶的失活反应5 s，后4℃1 h，逆转录得到cDNA。用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测CollⅠmRNA的相对表达量。CollⅠmRNA的引物徐序列：上游引物TACAGCACGCTT GTGGATG，下游引物TTGGGATGGAGGGAGTTTA，片段大小为320 bp。内参基因GAPDH引物是：上游TGAACGG GAAGCTCACTGG，下游TCCACCACCCTGTTGCTGTA，片段大小为200 bp。RT-PCR的反应条件为：94℃预变性10s；94℃变性5 s，退火30 s，共40循环；溶解曲线94℃60 s，57.6℃30 s，94℃30 s，1个循环。经 1.7%琼脂糖凝胶电泳分离。分离产物用YLN-2000凝胶成像分析系统分析吸光度，以GAPDH作内参，以目的基因吸光度比内参基因吸光度代表目的基因的相对含量。

2.7统计学方法采用SPSS15.0统计软件进行数据的分析，定量资料用(±s)表示，组间比较采用t检验。

3　结果

3.1成骨细胞形态学观察及鉴定见图1和图2。倒置显微镜下观察，原代培养第3天的大鼠成骨细胞呈三角形、多边形、长梭形，胞浆丰富，胞核较圆，轮廓清晰。ALP定性染色对其进行鉴定，可见成骨细胞胞浆蓝染，呈阳性。

3.2各组成骨细胞增殖结果比较见表1。与正常组比较，葛根素各浓度组OD值均显著增高，差异均有统计学意义(P＜0.01)；高糖组、高糖+葛根素各浓度组明显低于正常组，差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。与高糖组比较，高糖+葛根素各浓度组OD值均显著增高，差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。

图1　成骨细胞形态 (40×)

图2　ALP化学染色 (40×)

表1　各组成骨细胞增殖结果比较(±s，n=8)

表1　各组成骨细胞增殖结果比较(±s，n=8)

与正常组比较，①P＜0.05，②P＜0.01；与高糖组比较，③P＜0.05，④P＜0.01

组别正常组高糖组葛根素各浓度组浓度(mol/L)高糖+葛根素各浓度组10-810-710-610-810-710-6O D值0.561±0.063 0.245±0.018②0.745±0.085②④0.737±0.030②④0.735±0.016②④0.442±0.025①④0.436±0.036①③0.429±0.045①③

3.3各组成骨细胞ALP活性结果比较见表2。与正常组比较，葛根素各浓度组细胞ALP活性显著增高，差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)；高糖组、高糖+葛根素各浓度组细胞ALP活性明显低于正常组，差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。与高糖组比较，高糖+葛根素各浓度组细胞ALP活性均显著增高，差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。

3.4各组成骨细胞CollⅠmRNA表达结果比较见表3。与正常组比较，葛根素各浓度组细胞CollⅠmRNA表达显著增高，差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)；高糖组、高糖+葛根素各浓度组细胞CollⅠmRNA表达明显低于正常组，差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。与高糖组比较，高糖+葛根素各浓度组细胞CollⅠmRNA表达均显著增高，差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。

表2　各组成骨细胞ALP活性结果比较(±s，n=8)

表2　各组成骨细胞ALP活性结果比较(±s，n=8)

与正常组比较，①P＜0.05，②P＜0.01；与高糖组比较，③P＜0.05，④P＜0.01

组别正常组高糖组葛根素各浓度组浓度(mol/L)高糖+葛根素各浓度组10-810-710-610-810-710-6O D值1.091±0.041 0.54±0.023②1.378±0.026②④1.308±0.026①④1.268±0.030①④0.665±0.023①④0.609±0.014①③0.621±0.022①③

表3　各组成骨细胞CollⅠmRNA表达结果比较(±s，n=8)

表3　各组成骨细胞CollⅠmRNA表达结果比较(±s，n=8)

与正常组比较，①P＜0.05，②P＜0.01；与高糖组比较，③P＜0.05，④P＜0.01

组别正常组高糖组葛根素各浓度组浓度(mol/L)高糖+葛根素各浓度组10-810-710-610-810-710-6O D值0.801±0.043 0.453±0.032②1.154±0.024②④0.958±0.036①④0.864±0.010①④0.625±0.023①④0.529±0.024①③0.516±0.022①③

4　讨论

随着老龄化程度的加剧、饮食结构及生活习惯的改变，DM发病率及检出率日趋增高，预计2025年全球DM发病人数将超过3亿，我国将达3800万[5]。DM作为一种代谢性疾病，严重影响骨代谢和骨改建，造成骨丧失，是骨质疏松症的重要原因之一。DOP作为DM的慢性并发症之一，是一种以骨量减少、骨质微观结构退化为特征，骨脆性增加，易于发生骨折的全身性骨骼疾病。研究发现[6]，DM患者骨质疏松症的发病率为50%左右，并且随着年龄增加、胰岛功能衰竭，合并DOP的危险性也随之增加。现如今，DOP因其高发病率、致残率和致死率日益受到医学界的重视。大量研究表明，DOP除与性别、年龄、病程等因素有关外，与患者胰岛素不足、胰岛素生长因子-1缺乏、晚期糖基化终末产物(AGEs)积累等因素有关[7]。

研究表明葛根素是中药葛根的主要成分之一，它有类似于雌激素的化学结构。近些年葛根素的研究证实其可以作为防治绝经后骨质疏松的药物，起到雌激素样效应，而且毒副作用相对较小[8]。葛根素具有扩张心脑血管、增加心脑血流量、抗动脉粥样硬化、调节血管内皮细胞功能、抗氧化、清除自由基和抑制缺血再灌注损伤等作用，具有活血化瘀的功效，在糖尿病的临床治疗中有一定的应用[9]。本研究表明，葛根素能明显改善高糖培养下成骨细胞的增殖和分化，增加ALP活性，促进CollⅠmRNA的表达，减轻高糖环境对骨组织代谢及成骨细胞增殖分化的损伤，起到保护作用。

综上所述，本研究表明高血糖状态下，破骨/成骨活性的平衡被破坏，导致糖尿病骨质疏松的发生，而葛根素的有效活性成分异黄酮可恢复上述平衡，维持正常骨量和骨的生物学质量，随着现代医药科学研究的不断深入，以葛根为原料的植物雌激素成为研发治疗糖尿病性骨质疏松症新药更好的选择。

[1]Reginster JY，Burlet N.Osteoporosis：a stillincreasing prevalence[J].Bone，2006，38(Suppl1)：4-9.

[2]Korpelainen R，Korpelainen J，Heikkinen J，et al.Lifelong risk factorts for osteoporosis and fracture in elderly women with low boby mass index a populationbased study[J].Bone，2006，39(2)：385-391.

[3]赵瑛，李蔚，祖莹，等.葛根素对实验性代谢综合征大鼠血脂影响的研究[J].中国中医药科技，2007，14(1)：29-30.

[4]晁海鹏，孙玉明.葛根素防治绝经后骨质疏松症的研究进展[J].中国中医药信息，2011，28(1)：112-113.

[5]杨敏，柳洁.中国糖尿病防治现状[J].中国医学创新，2014，11(7)：149-151.

[6]Jackuliak P，Payer J.Osteoporosis，fractures，and diabetes[J].Int J Endocrinol，2014：820615.

[7]Lin N， Zhang H，Su Q.Advancde glycation endproducts induce injury to pancreatic betacells through oxidative stress[J].Diabetes Metab，2012，38(3)：250-257.

[8]杨勇晖，陈平洋.葛根素防治骨质疏松的研究进展[J].中国骨质疏松杂志，2015，21(3)：376-378.

[9]Aoki A，Muneyuki T，Yoshida M，et al.Circulating osteocalcin is increased in early-stage diabetes[J].Diabetes Res Clin Pract，2011，92(2)：181-186.

（责任编辑：冯天保，郑锋玲）

Effect of Puerarin on Proliferation and Differentiation of Osteoblastic Cells and Expression of Type I Collagen mRNA

WANG Xiaohui，LUO Xiangxia，SHI Xiaowei，ZHANG Dinghua

Objective：To discuss the effect of puerarin on proliferation and differentiation of osteoblastic c ells cultured in high glucose and the expression of type I collagen mRNA，and provide experimental basis for the clinical treatment of diabetes and osteoporosis.Methods：Cranium of newborn SD rats within 24 hours was obtained，isolated and cultured in virto until becoming osteoblasts cells.When the forms of cells became stable，osteoblasts cells in exponential growth period were selected and divided into normal glucose group，high glucose group(22 mmol/L glucose)，the puerarin of different concentrations group(concentrations of puerarin being respectively 10-8mol/L，10-7mol/L，10-6mol/L)and high glucose combined with puerarin of different concentrations group.For each group，8 parallel holes were designed and all groups were cultured for 48 hours，adding medicine to each group after medium change the next day.Measured the ability of proliferation of osteoblastic cells，activity of alkaline phosphate(ALP)in cells and expression of Coll I mRNA.Results：Comparing with normal glucose group，OD level，activity of ALP in cells as well as expression of Coll I mRNA of the puerarin of different concentrations group were increased obviously(P＜0.05，P＜0.01)，and those of high glucose group and high glucose combined with puerarin of different concentrations group were significantly lower than those of normal glucose group(P＜0.05，P＜0.01).Comparing with high glucose group，OD level，activity of ALP in cells and expression of Coll I mRNA in cells of high glucose combined with puerarin of different concentrations group were all raised obviously，displaying significant difference (P＜0.05，P＜0.01).Conclusion：Under the condition of high glucose，the proliferation and differentiation of osteoblastic cells and expression of type I collagen mRNA will be inhibited，but after adding with puerarin，the efficacy can be improved，which suggests that purearin has therapeutic effect on diabetes and osteoporosis.

Puerarin；Osteoblastic cells；Proliferation；Differentiation；Type I collagen；Newborn SD rats；Cell culture

R285

A

0256-7415（2016）11-0221-04

10.13457/j.cnki.jncm.2016.11.094

2016-06-12

甘肃省自然科学基金项目（1308RJZA136）

王晓晖（1970-），女，副主任医师，研究方向：内分泌及代谢性疾病。