低剂量辐射通过诱导局部SDF1/CXCR4高表达促进大鼠糖尿病皮肤损伤愈合

张海峰 程艳丽 王洪莎 雷嫚嫚 魏 祺 郭蔚莹

(吉林大学第一医院介入治疗科，吉林 长春 130021)



低剂量辐射通过诱导局部SDF1/CXCR4高表达促进大鼠糖尿病皮肤损伤愈合

张海峰 程艳丽1王洪莎1雷嫚嫚1魏 祺1郭蔚莹1

(吉林大学第一医院介入治疗科，吉林 长春 130021)

目的 探讨低剂量辐射促进糖尿病(DM)皮肤损伤愈合的分子机制，明确SDF1、CXCR4在创面愈合过程中的作用。方法 制备DM皮肤损伤大鼠模型，分为2组，其中照射组(RDM组)给予75 mGy的X射线照射，6 min·次-1·d-1，照射5 d，间隔2 d，总共照射15 d。另一组为DM大鼠非照射组(DM)组；同时以正常大鼠皮肤损伤自然愈合为对照组(NDM组)。分别在创面愈合的7、14、21 d，通过创面愈合面积、免疫组化和蛋白印记方法观察低剂量辐射对DM皮肤损伤创面愈合的影响，确定辐照对皮肤创面组织表达SDF1/CXCR4的调节作用。结果 DM大鼠创面存在难以愈合及愈合延迟的现象。RDM组大鼠的创面愈合率明显高于未照射组(P<0.01)；免疫组化结果显示DM组创面边缘的SDF1和CXCR4蛋白表达明显低于正常大鼠(P<0.01)，RDM组SDF1和CXCR4蛋白与DM组相比增加(P<0.01)；采用蛋白印记方法分析创面愈合过程SDF1/CXCR4的动态表达，结果显示RDM组7 d SDF1表达与DM组相比增加2.8倍。关联分析发现，SDF1表达强度与创面微血管密度密切相关。结论 低剂量辐射参与创面修复整个过程，通过诱导DM皮肤创面局部组织分泌大量的SDF1，招募外周血中EPCs，促进局部新生血管生成，加速创面愈合。

低剂量辐射；SDF1/CXCR4；糖尿病

糖尿病患者皮肤损伤后的愈合能力下降已经成为导致糖尿病患者致死致残的重要原因之一。越来越多关于糖尿病及糖尿病慢性并发症研究发现，糖尿病患者多伴有内皮祖细胞(EPC)数量减少以及功能不良，EPC功能受损可能在糖尿病血管并发症的发生发展中扮演了重要的角色〔1〕。笔者前期工作发现，对于骨髓中内皮祖细胞，低剂量辐射能够促进其从骨髓向外周血循环的动员，具有显著的兴奋性效应，可提高糖尿病创口的愈合效率，缩短愈合时间，促进创面的上皮化和促进胶原组织合成〔2〕。在皮肤创面愈合过程中，基质细胞衍生因子-1(SDF-1)及其特异性受体CXCR4组成的SDF-1/CXCR4轴起重要作用。Akita等〔3〕将低氧环境下诱导的EPCs移植给免疫缺陷的裸鼠下肢，结果表明,移植EPCs的裸鼠缺血下肢有明显血管新生。本研究通过对糖尿病大鼠皮肤创面的复制，应用免疫组织化学染色、蛋白印记方法，动态观察低剂量辐射在糖尿病创面愈合过程对局部创面SDF1和CXCR4表达的影响。

1 材料和方法

1.1 动物模型制备 Wistar大鼠购于吉林大学基础医学院动物中心，糖尿病大鼠模型制备采用50 mg/kg链脲佐菌素(STZ)行左下腹腔一次性注射。血糖达到16.7 mmol/L可判定为糖尿病造模成功。模型建立成功后继续饲养8 w，制备皮肤损伤模型：2.5%戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，剪去脊背部的毛，70%酒精清洁消毒，无菌条件下切除面积为9 cm2(直径约3.4 cm)圆形皮肤，深达皮下组织全层的皮肤创口。将糖尿病大鼠随机分为2组，75 mGy照射组(NDM)、糖尿病自然愈合组(DM)，以非糖尿病皮肤缺损模型为对照组(NDM)，每组24只。

1.2 照射条件及样本收集 低剂量辐射的剂量为75 mGy，剂量率为12.5 mGy/min，每天照射6 min/次，连续照射5 d，休息2 d，共计照射15次。分别在照射后7 d、14 d和21 d时间点行创面照相，计算创面愈合率。然后取创面边缘皮肤，部分10%的中性甲醛固定，石蜡包埋，部分取新鲜组织-80℃冻存。

1.3 免疫组化 采用SABC法，按试剂盒操作：石蜡切片脱蜡和水化后，0.01 mol/L的PBS洗涤3 min×3，置于柠檬酸缓冲液中92℃～95℃ 孵育20 min，修复抗原，室温自然冷却至37℃；加50 μl过氧化酶阻断溶液，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化酶活性，PBS冲洗3 min×3；切片加50 μl山羊血清，室温下孵育10 min；除去血清，每张切片加50 μl第一抗体1∶100(兔抗-CD34，兔抗-SDF1，兔抗-CXCR4)；4℃孵育过夜。PBS冲洗3 min×3，加50 μl生物素标记的第二抗体，室温下孵育10 min，PBS冲洗3 min×3；每张切片加50 μl链霉菌抗生物素-过氧化酶溶液，室温下孵育10 min，PBS冲洗3 min×3；加入DAB溶液显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。染色均设有PBS(代替一抗)的阴性对照。结果判定采用KS400图像分析系统(德国Kaiser公司)分析。

1.4 蛋白印记 新鲜保存的皮肤边缘组织50 mg，剪碎，加入细胞裂解液500 μl，超声破碎，12 000 r/min离心取上清，采用BCA法进行蛋白定量，样品按4∶1加入5 ×上样缓冲液,混匀后95℃10 min 变性。上样行SDS-PAGE电泳：半干法电转移凝胶上的蛋白带至PVDF膜上，转移后的PVDNF膜加5% 脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗SDF1或CXCR4(CST公司 1∶1 000)4℃孵育过夜,孵育后的PVDF膜经TBST洗膜3次,每次15 min，加入相应二抗(HRP标记羊抗兔IgG),稀释浓度为1∶2 000，室温孵育2 h，孵育后TBST洗膜3次，然后加入化学发光底物SuperSignal，暗室中行X光胶片曝光，显影和定影，β-actin作为内参照。

1.5 结果观察 创面愈合采用公式计算：愈合面积=初始创面面积-各时相点面积；创面愈合面积百分比=(愈合面积/初始创面面积)×100%。采用Adobe Image Ready7.0和Osiris软件进行面积计算。创面微血管密度(MVD)计数：以抗CD34单克隆抗体标记显示血管内皮细胞，孤立的棕黄色血管内皮细胞或细胞簇代表1条单独的微血管。依据Pareek等〔4〕的方法，先在低倍视野内(×100)选择CD34标记的MVD高的区域，然后在高倍视野内(×200)计数3个视野，取平均值作统计学处理。

2 结 果

2.1 低剂量辐射对DM大鼠创面愈合能力的影响 正常大鼠皮肤创面在21 d后基本愈合，DM大鼠的皮肤创面愈合能力显著低于正常大鼠，愈合速度减慢，愈合时间延长。显示合并DM大鼠伤口存在愈合能力下降及愈合速度延迟。RDM组大鼠的创面愈合率明显高于未照射组(P<0.01)。照射后14 d，创面愈合差别最大。见表1，结果提示低剂量辐射有促进DM皮肤损伤愈合的作用。

表1 不同时间点各组大鼠愈合面积比较±s，n=8，cm2)

RDM组与DM组比较：1)P<0.01；NDM组与DM组比较：2)P<0.05；表2同

2.2 低剂量辐射对DM大鼠皮肤创面边缘SDF1/CXCR4蛋白表达的影响 CXCR4定位于皮下间质区域的细胞，阳性表达为褐色。定量分析显示，DM组创面边缘的SDF1和CXCR4蛋白表达明显低于NDM组，且DM组SDF1阳性细胞分布区域较窄，见图1。RDM组SDF1和CXCR4蛋白与DM组相比增加(P<0.05)。采用蛋白印记方法分析创面愈合过程中SDF1/CXCR4的动态表达，结果显示，正常大鼠皮肤损伤后7 d SDF1表达到高峰，21 d降低，DM大鼠SDF1的变化趋势与其相似，但表达较弱，照射后7 d SDF1表达与DM组相比增加2.8倍。见图2。

图1 SDF1、CXCR4在DM大鼠皮肤伤愈组织中的表达(14 d，Bar=50 μm)

1)DM组与NDM组比较：P<0.05;2)DM组与NDM组比较：P<0.01;3)RDM组与DM组比较：P<0.05图2 SDF1、CXCR4在伤愈过程中的动态变化

2.3 低剂量辐射增加DM大鼠皮肤创面边缘MVD 皮肤损伤后7 d，DM大鼠和正常大鼠损伤创面均有CD34阳性表达。随照射时间的延长，正常大鼠的皮肤创面中CD34阳性细胞呈现逐渐增多趋势，创面MVD增加，尤其是孤立的血管内皮细胞明显增加。至创伤愈合第14天，NDM组大鼠皮肤创面可见大量毛细血管增生，CD34呈强阳性表达。DM组大鼠皮肤创面为较零星散在的毛细血管增生，RDM组大鼠皮肤创面毛细血管则增生明显，MVD明显增加，见图3。定量分析显示，DM各组大鼠皮肤创面MVD值在伤后7、14、21 d均明显低于NDM组(P<0.01)。RDM组皮肤创面的MVD与DM组相比有显著性差异(P<0.05)。见表2。

表2 不同时间点各组大鼠创面MVD(个/160 μm×160 μm)比较

RDM组与DM组比较：1)P<0.05；NDM组与DM组比较：2)P<0.01

2.4 皮肤创面边缘组织MVD与SDF1/CXCR4蛋白表达的相关性分析 SDF1蛋白表达量与MVD值的变化呈现正直线相关(r=0.81，P<0.001)，即随着SDF1蛋白表达量的增加，MVD值亦增加。CXCR4蛋白表达与MVD值变化呈正相关(r=0.48，P<0.01)，SDF1与创面MVD关系更为密切。

图3 CD34在糖尿病大鼠皮肤伤愈组织中的表达(14 d，Bar=50 μm)

3 讨 论

糖尿病患者由于容易糖代谢，脂代谢及蛋白质代谢紊乱最终可引起血管内皮功能的异常，因此糖尿病患者一旦形成皮肤伤口，就面临着伤口的愈合能力下降及愈合时间延长问题〔5〕。文献报道，与非DM患者不同，2型糖尿病(T2DM)患者外周血液循环中EPCs的总体数量及功能均有不同〔1〕。DM越严重，则外周血循环中EPCs数量越少，二者呈明显负相关。低水平的外周血循环EPCs可能与内皮细胞的功能失调及新生毛细血管形成能力下降，侧支循环建立不良有密切的关系，因此EPCs在DM早期慢性并发症的发病机制中起着重要作用。笔者前期工作中发现，低剂量辐照合并皮肤受损的DM大鼠，创面平均愈合率明显高于单纯DM自然愈合组；流式细胞术检测骨髓和外周血中EPCs 数量，发现经LDR处理过得EPCs，无论是在骨髓中的增殖，还是向周围血循环中动员、迁移的能力均有显著性增加。因此，外周血循环中内皮祖细胞的数量明显增多，活性明显增强，参与促进血管再生和损伤血管的再内皮化〔2〕。充足归巢是EPCs发挥生物学功能，促进新生血管形成和损伤修复的关键环节。蛋白酶、细胞内信号传导、细胞黏附分子和多种趋化因子、趋化因子受体的共同作用最终决定了归巢位点激活新生血管形成这一复杂的生物学过程〔5〕。在本实验中笔者发现，75 mGy的X射线全身辐照局部皮肤受损的DM大鼠，其创面愈合率显著高于未干预DM组；低剂量辐射能够增加创面局部组织CD34阳性细胞数目和表达强度，促进局部微血管生成。结合前期工作发现LDR 促进骨髓EPCs动员和迁移，笔者推测LDR 促进DM皮肤损伤愈合可能与EPCs动员和创面局部对循环中EPCs招募密切相关。EPC可定向归巢到血管内皮细胞损伤部位或缺血组织，从而参与新生血管生成和修复，但何种机制促发了EPC归巢的始动信号，目前了解得很不全面。Hur等〔6〕通过在创面转染Akt基因，结果表明，EPC的定向归巢以及局部组织修复和新生血管重建的能力均明显提高，认为Akt信号途径在EPC的归巢机制中具有重要的作用。在创面愈合过程中，SDF-1及其受体CXCR4组成的SDF-1/CXCR4轴在造血祖细胞的动员、迁移及归巢过程中也发挥着重要作用〔7～9〕。EPCs细胞表达CXCR4蛋白，SDF-1通过结合CXCR4介导EPCs向缺血、缺氧及血管损伤区的归巢，SDF-1或CXCR4的阻断均可抑制祖细胞向缺血区或损伤区的归巢〔10，11〕。本文结果显示，DM组SDF-1/CXCR4蛋白表达较低，分布在皮下狭窄区域的间质细胞；局部SDF-1增高是低剂量辐射促进创面血管生成，加快创面愈合的主要因素。

Bermudez等〔12〕研究发现，在创面愈合过程中内皮细胞和成纤维细胞是分泌SDF-1的首要细胞。SDF-1的分泌数量直接决定了成纤维细胞的增殖活性高低，二者密切相关，且能够显著调控创面的愈合能力。本研究结果表明低剂量辐射参与创面修复整个过程，通过增加骨髓动员至外周的EPCs细胞，诱导糖尿病皮肤创面局部组织分泌大量的SDF1，招募外周血中EPCs，促进局部新生血管生成，加速创面愈合。同时成纤维细胞分泌的SDF1可促进细胞增生，修复创面。同样，在创面愈合的晚期，由于SDF-1分泌数量明显下降，成纤维细胞的增殖效应不再明显，同时伴有基质细胞的合成能力减弱，数量明显减少，由富含成纤维细胞的肉芽组织衍化为瘢痕组织，因此愈合的速度明显下降。

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3 Akita T，Murohara T，Ikeda H，etal.Hypoxic preconditioning augments efficacy of human endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization〔J〕.Lab Invest，2003;83：65-73.

4 Pareek G，Shevchuk M，Armenakas NA，etal.The effect of finasteride on the expression of vascular endothelial growth factor and microvessel density：a possible mechanism for decreased prostatic bleeding in treated patients〔J〕.J Urol，2003;169：20-3.

5 Petersen JL，McGuire DK，Harrington RA.Advances and continued controversy in coronary revascularization of patients with diabetes mellitus〔J〕.Curr Diab Rep，2003;3：351-5.

6 Hur J，Yoon CH，Lee CS，etal.Akt is a key modulator of endothelial progenitor cell trafficking in ischemic muscle〔J〕.Stem Cells，2007;25：1769-78.

7 Petit I，Jin D，Rafii S.The SDF-1/CXCR4 signaling pathway：a molecular hub modulating neo-angiogenesis〔J〕.Trends Immunol，2007;28：299-307.

8 Daniel J,Ceradini DY，Raymon H,etal.Gurtner decreasing intracellular superoxide corrects defective ischemia-induced new vessel formation in diabetic mice〔J〕.J Biol Chem,2008;283(16)：10930-8.

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10 Cheng M，Huang K，Zhou J，etal.A critical role of Src family kinase in SDF-1/CXCR4-mediated bone-marrow progenitor cell recruitment to the ischemic heart〔J〕.J Mol Cell Cardiol,2015；81：49-53.

11 Massberg S，Konrad I，Schürzinger K，etal.Platelets secrete stromal cell-derived factor 1alpha and recruit bone marrow-derived progenitor cells to arterial thrombi in vivo〔J〕.J Exp Med,2006;203(5)：1221-33.

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〔2016-06-09修回〕

(编辑 曲 莉)

国家自然科学基金(81300660)；吉林省发改委资助项目(2013C029-3)；吉林省科技厅白求恩专项(20160101035JC)；吉林省自然科学基金资助(2016010135JC)

郭蔚莹(1974-)，女，副教授，主要从事内分泌代谢学研究。

张海峰(1975-)，男，副教授，主要从事介入治疗学研究。

R815；R587.2

A

1005-9202(2016)22-5512-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.008

1 吉林大学第一医院内分泌代谢科