己烷体系中磷脂酶A1催化卵磷脂乙醇解制备溶血卵磷脂的研究

杨国龙 杨若茜 毕艳兰 孙尚德 陈竞男

(河南工业大学 粮油食品学院，郑州 450001)

己烷体系中磷脂酶A1催化卵磷脂乙醇解制备溶血卵磷脂的研究

杨国龙 杨若茜 毕艳兰 孙尚德 陈竞男

(河南工业大学 粮油食品学院，郑州 450001)

在己烷体系中，采用磷脂酶A1催化卵磷脂乙醇解制备溶血卵磷脂。首先通过单因素试验分别考察了加酶量、加水量、底物比、温度和溶剂比对卵磷脂乙醇解制备溶血卵磷脂的影响，并在此基础上利用响应面法对反应工艺进行了优化。最终确定最佳工艺条件为：卵磷脂1.5 g，加酶量40 μL/g(磷脂酶A1/卵磷脂)，加水量25 μL/g(水/卵磷脂(PC))，底物比：1∶3(PC/无水乙醇，mol/mol)，温度30 ℃，溶剂比：1∶2(PC/正己烷，W/V)，反应时间3.55 h，溶血磷脂转化率达98.3%。结果表明，磷脂酶A1可以催化磷脂酰胆碱乙醇解反应制备溶血磷脂酰胆碱。

己烷 磷脂酶A1卵磷脂 乙醇解 溶血卵磷脂

磷脂作为一种脂蛋白载体普遍存在于动植物细胞中，对调节生物膜的生物活性和机体的代谢有重要功能[1]。磷脂还具有乳化、分散、起泡、降低黏度和保持水分等功能，是天然的离子型表面活性剂，在食品业、饲料业、化妆品和洗涤剂等领域都有应用[2]。但是未经改性的磷脂的HLB值(亲水疏水平衡值)较低，在水相中不易分散，只能用做W/O型乳化剂，不适合做O/W型乳化剂，使用范围被大大限制[3-4]。已有文献报道，磷脂被改性后乳化稳定性、抗氧化性等都有很大提高[5]。溶血磷脂作为磷脂的改性产物既安全又高效，可应用于更加广泛领域。

根据磷脂酶催化磷脂水解制备溶血磷脂的反应原理[1]，本试验将羟基供体从水改为乙醇，选用专一作用于1-位酰基甘油键的磷脂酶A1，在己烷体系中催化大豆卵磷脂乙醇解制备溶血卵磷脂。

1 材料与方法

1.1 主要原料

大豆卵磷脂(PC≥98%)：沈阳天峰生物制药有限公司；磷脂酶A1(Lecitase Ultra，10 KLU/g)：诺维信(中国)生物技术有限公司；三氯甲烷、甲醇：天津科密欧试剂有限公司。

1.2 主要仪器

DF-101Z集热式恒温加热磁力搅拌器：河南省予华仪器有限公司；薄层棒状色谱-火焰离子化检测仪(IATROSCAN MK-6S)：三菱化学株式会社。

1.3 试验方法

1.3.1 磷脂酶A1催化卵磷脂醇解制备溶血卵磷脂

准确称取1.5 g卵磷脂于50 mL圆底烧瓶中，加入适量的无水乙醇与正己烷(均用分子筛脱水)后放于调至一定温度的恒温磁力搅拌器中混合均匀，然后加入适量的水和磷脂酶A1开始反应。定时取样分析产物中卵磷脂(PC)、溶血卵磷脂(LPC)、甘油磷脂酰胆碱(GPC)及其他物质含量，并计算LPC转化率。

LPC转化率=

1.3.2 原料卵磷脂及其醇解产物的组成分析

将样品溶解于色谱纯三氯甲烷中稀释至适宜浓度，取1 μL溶液点于薄层色谱棒上，在展开液(CHCl3/CH3OH/H2O, 42/22/2.5,V/V/V)中展开后干燥5 min，然后利用火焰离子检测器(FID)进行检测分析[6]。

2 结果与讨论

2.1 加酶量对溶血磷脂转化率的影响

由图1可得，当加酶量为40 μL时，由于加酶量较少，LPC转化率随反应时间的增加而缓慢增加，待5 h时反应结束后，LPC转化率仅为39.7%。当加酶量为50 μL时，LPC转化率的初始增长速率较加酶量为40 μL时明显加快，在反应1.5 h时，LPC转化率快速增至61.9%，而后增长速度明显减缓，反应5 h结束后达到81.4%。当加酶量为60和70 μL时，LPC转化率随时间的增长趋势基本一致，在反应0～1 h期间，LPC转化率分别迅速增长至81.7%和83.5%，而后增长速度逐渐减小，在3 h后分别达到96.0%和95.5%，并维持平衡状态。综合试验成本考虑，加酶量选择60 μL效果好。

注：PC：1.5 g；加水量：40 μL/g(水/PC)；底物比：1∶3(PC/无水乙醇，mol/mol)；温度：45 ℃；溶剂比：1∶3(PC/正己烷，W/V)。

图1 加酶量对LPC转化率的影响

2.2 加水量对溶血磷脂转化率的影响

酶促反应的进行需要适量的水，研究表明，在疏水性溶剂体系中，酶表现最高活性所需的水要少于在亲水性溶剂时所需要的量[7]。本试验选用具有疏水性的正己烷为溶剂，虽然酶必需水的量有所降低，但过低的加水量会使酶分子的柔性变差，从而抑制酶的活性。反之，如果加水量过多，会造成过多水解副反应，同样不利于试验进行。

注：PC：1.5 g；加酶量：60 μL；底物比：1∶3(PC/无水乙醇，mol/mol)；温度：45 ℃；溶剂比：1∶3(PC/正己烷，W/V)。

图2 加水量对LPC转化率的影响

由图2可得，当加水量为20 μL/g时，醇解反应进程缓慢，水分的不足严重抑制了磷脂酶的活性，反应5 h后，LPC转化率仅为54.2%。当加水量为25 μL/g时，酶的活性较加水量为20 μL/g的情况有所改善，LPC转化率初始增长速率明显加快，待反应2 h后，LPC转化率已增长至52.8%，随后醇解反应进程明显减缓，反应5 h结束后LPC转化率较低，仅为70.4%。当加水量为30 μL/g时，一开始反应，LPC转化率就迅速增加，仅仅2 h，就已经增长至79.4%，待反应5 h结束后增至90.9%，已处于平衡状态。当加水量为35 μL/g时，LPC转化率的初始增长速率较加水量为30 μL/g时更快，反应2 h时，LPC转化率就已达到83.7%，反应5 h结束时，LPC转化率进一步增长至94.9%，并且表现出持续增长的趋势。

2.3 底物比对溶血磷脂转化率的影响

由图3可知，当底物比为1∶2时，由于乙醇含量较低，羟基供体不足，醇解反应无法充分进行，LPC转化率的增长速度一直比较缓慢，在反应5 h结束时，仅为52.2%。但是，由于乙醇是种亲水性有机溶剂，会夺取酶分子的必需水，从而抑制酶活性，因此如果乙醇含量较高，也会降低磷脂醇解率[8-9]。正如底物比为1∶4时显示出的情况，虽然LPC转化率较底物比为1∶2时有所增加，但是醇解反应仍不充分，待反应进行5 h结束时，LPC转化率仅能达到76.9%。当底物比为1∶3时，乙醇含量较为适宜，LPC转化率的增长情况较1∶2和1∶4时大大提高，仅反应3 h，转化率已快速增至87.7%，并基本达到稳定状态。

注：PC：1.5 g；加酶量：60 μL；加水量：30 μL/g(水/PC)；温度：45 ℃；溶剂比：1∶3(PC/正己烷，W/V)。

图3 底物比对LPC转化率的影响

2.4 温度对溶血磷脂转化率的影响

由图4可知，在反应温度仅为30 ℃时，LPC转化率在0～20 min呈现出近乎直线的增长形式，迅速达到60.3%，仅经过2 h，已达到了97.9%，并保持平衡。当反应温度为35 ℃时，LPC转化率的初始增长速率较温度为30 ℃时更快，反应进行20 min时LPC转化率为78.2%，随后于反应1.5 h时增长至96.7%，并保持平衡状态。Wang等[10]在水解大豆磷脂时对Lecitase Ultra进行了热稳定性试验，证明了水解磷脂时，磷脂酶A1是一种在较低温度下就能表现较高酶活性的酶，这与本试验所表现出来的情况基本一致。当反应温度为40 ℃时，LPC转化率的初始增长速率较温度为30 ℃时有所减缓，反应进行20 min时LPC转化率为50.7%，在反应3 h时增长至97.7%，并维持平衡状态。虽然温度越高，分子运动越剧烈，但当反应温度升至45 ℃时，LPC转化率的增长情况较30、35和40 ℃时已有明显降低，反应5 h后，LPC转化率才增长至90.9%，说明酶的分子结构已开始受到破坏。当反应温度为50 ℃时酶活性已显著下降，整个反应过程中LPC转化率增长速度都十分缓慢，待5 h反应结束后，LPC转化率只能达到31.0%。

注：PC：1.5 g；加酶量：60 μL；加水量：30 μL/g(水/PC)；底物比：1∶3(PC/无水乙醇，mol/mol)；溶剂比：1∶3(PC/正己烷，W/V)。

图4 温度对LPC转化率的影响

2.5 溶剂比对溶血磷脂转化率的影响

磷脂乙醇溶液黏度较大，为了提高磷脂的溶解性，本试验选取正己烷为溶剂[11]。由图5可得，当溶剂比为1∶1时，因体系中的传质阻力大，LPC转化率持续缓慢增长，反应5 h后仅增至44.9%。当溶剂比为1∶2时，体系中传质阻力明显减小，LPC转化率初始增长速率显著加快，在反应0.5 h后LPC转化率迅速增加至67.4%，随后增长速率趋于平缓，在反应2 h后达到98.0%，保持平衡状态。当溶剂比为1∶3时，体系中传质阻力进一步减小，LPC转化率的初始增长速率较底物比为1∶2时更加迅速，在反应0.5 h后LPC转化率达到78.0%，于2 h后增长至98.2%，也处于平衡状态。溶剂越多，分子密度越小，分子碰撞概率降低，因此当溶剂比为1∶5和1∶10时LPC转化率的初始增长速率均有所降低，LPC转化率在反应0.5 h时分别为55.1%和33.5%，在3 h后达到平衡状态并增至98.2%和98.4%。

注：PC：1.5 g；加酶量：60 μL；加水量：30 μL/g(水/PC)；底物比：1∶3(PC/无水乙醇，mol/mol)；30 ℃。

图5 溶剂比对LPC转化率的影响

2.6 响应面优化试验

综合考虑5个因素对试验的影响，使用Design Expert 8.0软件对LPC转化率的优化选取四因素三水平的响应面设计，具体试验方案和试验结果如表1。

表1 试验方案和结果

表2 方差分析结果

注：**：极显著(P<0.001)；*：显著(P<0.05)。

优化试验结果及验证如表3。由表3可知，理论值与实际值相差不大，说明利用响应面优化得到的工艺条件真实可靠，对实际生产具有一定指导作用。

图6 因素间的交互作用对LPC转化率的影响

加酶量/μL/g加水量/μL/g温度/℃时间/h理论LPC转化率/%实际LPC转化率/%4025303.5599.4%(98.3±0.8)%

3 结论

对正己烷体系中磷脂酶A1(Lecitase Ultra)催化磷脂酰胆碱乙醇解制备溶血磷脂的反应条件进行了深入研究，然后利用响应面软件建立了该反应的数学模型，并对模型进行了优化设计，得到最优工艺条件：卵磷脂1.5 g，加酶量/40 μL/g，加水量25 μL/g，底物比：1∶3(PC/无水乙醇，mol/mol)，温度30 ℃，溶剂比：1∶2(PC/正己烷，W/V)，反应时间3.55 h，使得LPC转化率可高达98.3%。结果表明，磷脂酶A1(Lecitase Ultra)可以催化磷脂酰胆碱乙醇解反应制备溶血磷脂酰胆碱。

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Preparation of the Lysophosphatidylcholine by Phospholipase A1-Catalyzed Ethanolysis of Soybean Phosphatidylcholine in Hexane

Yang Guolong Yang Ruoxi Bi Yanlan Sun Shangde Chen Jingnan

(Grain School,Henan University of Technology, Zhengzhou 450001)

Preparation of the lysophosphatidylcholine (LPC) applying ethanolysis of soybean phosphatidylcholine (PC) by phospholipase A1(Lecitase Ultra) in hexane has been studied in the paper. Effects of the reaction factors including phospholipase A1dosage, water content, substrate ratio, reaction temperature and solvent content on the LPC conversion of the phospholipase A1-catalyzed ethanolysis of soybean phosphatidylcholine have also been studied. Based on the single-factor experiments, the reaction conditions were optimized with Response Surface Method. The optimal conditions were as follows: PC of 1.5 g, phospholipase A1dosage of 40 uL/g (phospholipase A1/PC,V/W), water content of 25 uL/g (water/PC,V/W), substrate ratio of 1∶3 (PC/ethanol, mol/mol), solvent content of 1∶2 (PC/hexane,W/V), reaction temperature at 30 ℃, reaction time for 3.55 h. On these conditions, the convertion rate of LPC could be 98.3%. The results showed that the phospholipase A1(Lecitase Ultra) was able to catalyze ethanolysis of PC to prepare LPC.

hexane, phospholipase A1, phosphatidylcholine, ethanolysis, lysophosphatidylcholine

TS229

A

1003-0174(2016)03-0064-05

国家自然科学基金(31071558)，河南省高等学校青年骨干教师资助计划(2011GGJS-079)

2014-07-24

杨国龙，男，1974年出生，副教授，脂质化学与生物技术