生鲜乳中皮革水解蛋白的检测及应用

陈 磊

（新疆兵团畜牧兽医工作总站，新疆乌鲁木齐830063）

生鲜乳中皮革水解蛋白的检测及应用

陈 磊

（新疆兵团畜牧兽医工作总站，新疆乌鲁木齐830063）

为测定生鲜乳中皮革水解蛋白，采用UV法检测农业部生鲜乳比对盲样和2011-2015年兵团9个师的生鲜乳收购站及生鲜乳运输车的生鲜乳，按3∶1比例进行抽检样品的L-羟脯氨酸。结果显示：L-羟脯氨酸的浓度在0～1.5 mg/L范围呈良好的线性关系，线性相关系数为0.9993，L-羟脯氨酸的回收率为96.16％～104.84％，相对标准偏差为3.32％，农业部生鲜乳盲样比对结果全部通过，检测634批次生鲜乳均未检出皮革水解蛋白。此检测方法对兵团生鲜乳中皮革水解蛋白的测定提供重要的科学依据。

生鲜乳；L-羟脯氨酸；皮革水解蛋白

10.16863 /j.cnki.1003-6377.2016.06.008

皮革水解蛋白是利用已经废弃的皮革制品和动物毛发，水解后将其制成粉末状，再掺入到牛奶或着奶粉中去，用以提高奶制品中蛋白质的浓度，这种掺杂有皮革水解蛋白的奶制品食用后，会致使身体消化不良，吸收及利用率降低，长时间饮用会导致人体中毒，影响了人体健康[1]。2009年2月6日，中国卫生部公布了《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第二批）》，其中共4个指标，就包含有“皮革水解蛋白”。检测鲜奶中的皮革水解蛋白，实际就是检测鲜奶中的L-羟脯氨酸[2]。

1 材料与方法

1.1 主要的试剂和材料

L-羟脯氨酸标准品（中国食品药品检定研究院提供，批号111578-200201）；氯胺T、对二氨基苯甲醛、HCl、苯酚、柠檬酸、NaOH、结晶乙酸钠、正丙醇均为分析纯；去离子水。

生鲜乳样品：来自兵团九个师生鲜乳奶站和运输车。

1.2 主要仪器设备

TU-1901紫外分光光度仪、水浴锅、电热恒温干燥箱、移液器。

1.3 试剂配制

1.3.1 配制缓冲液

把50.0 g的一水合柠檬酸、26.3 g的NaOH和146.1 g的乙酸钠溶解于去离子水中，定容到1 L，再依次的加入200mL的去离子水和300 mL的正丙醇，混合均匀。

1.3.2 配制氯胺T溶液

把1.41 g的氯胺T，溶解于10mL去离子水中，再依次的加入10 mL的正丙醇和80mL的缓冲液（1.3.1）后，混合均匀，现用现配。

1.3.3 配制显色剂

将10.0 g的对二甲胺基苯甲醛，溶解于35 mL的高氯酸中，再缓慢的加入65 mL的异丙醇后，混合均匀，现用现配。

1.3.4 L-羟脯氨酸标准储备液（500mg/L）

用0.02mol/LHCl溶液将50.0mg/L-羟脯氨酸标准品溶解，定容到100mL。静置于4℃冰箱，有效期为6个月。

1.3.5 L-羟脯氨酸标准工作液（5.00mg/L）

用0.02mol/LHCl溶液稀释1.0mL的L-羟脯氨酸标准储备液（1.3.4），定容到100mL，现用现配。

1.4 试验方法

1.4.1 样品制备

准确吸取5.00mL(V1)混匀的生乳样品于玻璃水解管中，加5.00mLHCl摇匀密封后，置于110℃电热恒温干燥箱内，水解作用12 h（计时1 h后，取出玻璃水解管轻轻摇动数次）。水解作用结束后，待溶液温度下降至室温，将溶液混合均匀用滤纸进行过滤，用水反复冲洗玻璃水解管和漏斗，滤液用容量瓶定容至100 mL（V2），摇匀。分别用10mol/L和1mol/L的氢氧化钠溶液调节10.0m L（V3）水解液pH值至8.0±0.2，用容量瓶定容到50 mL（V4），摇匀，作为试液留存备用。同时制备空白试剂对照和阳性添加。

1.4.2 制备阳性添加

分别量取L-羟脯氨酸标准储备液（500mg/L）125 L、500 L、1 000 L，再分别加入5mL的空白生鲜乳，配制成12.5 g/mL、50 g/mL、100 g/mL的阳性添加试料。

1.5 绘制标准曲线

吸取L-羟脯氨酸标准工作液（1.3.5）0.00mL、5.00 mL、10.00 mL、15.00 mL、20.00 mL和30.00 mL，分别加入去离子水，用容量瓶分别定容到100mL，摇匀。配制成浓度分别为0.00mg/L、0.25mg/L、0.50mg/L、0.75mg/L、1.00 mg/L和1.50mg/L的溶液。各种浓度的溶液取5.00mL，分别加入到25mL的具塞比色管内，再加入2.00 mL配制好的氯胺T溶液（1.3.2），摇匀，室温静置20min。加入2.00 mL的显色剂（1.3.3），摇匀后密封，60℃水浴20min，溶液置入20℃水中快速降温，用分光光度计测定波长560 nm处的吸光度值，绘制标准曲线，测定结果需40min内完成。

1.6 试液测定

从试液（2.1）中吸取5.00mL于25mL具塞比色管中，按照3.1的方法进行操作，在560 nm波长处测定吸光度值，40 min内完成测定。从得到的标准曲线上计算得到L-羟脯氨酸的浓度(C)，L-羟脯氨酸含量(X)的计算：

计算公式：X=CV2V4/V1V3

2 结果

2.1 标准曲线

在560 nm波长处测定吸光度值，做标准曲线（见图1），得到线性回归方程为：y=0.2167x+0.0006，R2=0.9993。从图1可知，吸光度和浓度呈良好的线性关系，线性范围是0～1.5 mg/L。

表1 标准曲线的绘制

图1 L-羟脯氨酸标准曲线

2.2 加标回收率

按照本试验方法对阳性添加进行测定，得到回收率结果见表2。由表2可以看出其加标回收率在96.16％～104.84％。相对标准偏差为3.32％。

表2 L-羟脯氨酸回收率g/m L％)（

2.3 应用

应用此方法参加农业部生鲜乳盲样比对，连续5年结果全部通过考核（见表3）。

表3 近年来参加农业部比对结果（mg/mL％)

应用上述生鲜乳中皮革水解蛋白的检测方法对兵团9个师的生鲜乳收购站及生鲜乳运输车的生鲜乳按3：1比例进行抽检，2011-2015年共检测生鲜乳650批次，均未检测出皮革水解蛋白（见表4）。

表4 兵团生鲜乳中皮革水解蛋白检测结果

3 讨论

用UV方法对兵团近5年抽检的634批次生鲜乳进行L-羟脯氨酸检测，均未检出，说明兵团乳品中未添加皮革水解蛋白。

应用此方法参加农业部生鲜乳盲样比对结果符合农业部要求，通过考核。说明用该方法检测生鲜乳中皮革水解蛋白可行。

本试验方法测定生鲜乳中皮革水解蛋白的浓度，实验检测条件稳定，变异系数较小，其准确度较好，加标回收率较高，对仪器要求较低，消耗试验成本较低，操作方便简单。应用此方法对兵团生鲜乳中皮革水解蛋白进行检测具有重要的科学依据和指导意义。

[1]孔晓锋,古丽曼,达成彪，等.紫外分光光度法测定生鲜乳中动物水解蛋白L-羟脯氨酸含量[J].饲料工业，2011(4):60-61.

[2]刘学琴,徐栓朝，等.生鲜乳制品中添加皮革水解蛋白的测定方法研究[J].乳业科学与技术,2010，（4）：188-192.

Detection and App lication of Ieather Hydrolyzed Protein in Fresh M ilk

CHEN Lei
（Animal Husbandry and Veterinary Station of Xinjiang Production and Construction Corps, Urumqi830063，China）

In order to determine the hydrolysis protein of leather in raw milk.The acquisition of raw milk and raw milk vehicle testing station of Ministry of agriculture of fresh milk intercomparison and 2011-2015 Corps 9 division with the UV method for sampling fresh milk samples according to the proportion of 3:1 L-hydroxyproline.The results showed that the concentration of hydroxyproline L-was linear in the range of 0 mg/L-1.5 mg/L,the linear correlation coefficient is 0.9993,the recovery rate was 96.16％～L-were 104.84％, the relative standard deviation is 3.32％,the Ministry of agriculture of fresh milk all through the comparison results,the detection of 634 batches of fresh milk were not detected in leather hydrolyzed protein.This detection method provides an important scientific basis for the determination of the hydrolyzed protein in raw milk.

freshmilk;L-hydroxyproline;leather hydrolyzed protein

S879.1

A

1003-6377（2016）06-0034-04

陈磊（1971-），女，农学硕士，高级兽医师，主要从事动物疫病及畜产品药物残留检测工作。E-mail：736429476@qq.com

2016-10-03，

2016-10-16