隔核Ghrelin对糖尿病大鼠胃运动的影响

闫长虹，霍兴华，刘慧霞，吕昆（菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000）

隔核Ghrelin对糖尿病大鼠胃运动的影响

闫长虹，霍兴华，刘慧霞，吕昆
（菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000）

目的探讨隔核Ghrelin对糖尿病大鼠胃运动的调控。方法链脲佐霉素腹腔注射制备糖尿病大鼠模型；荧光免疫组化检测糖尿病大鼠隔核内Ghrelin受体GHS-R1a表达变化；大鼠胃表面固定感应片在体记录胃运动并计算胃运动变化率；并采用中枢注射药物法观察隔核对糖尿病大鼠胃运动的调控作用。所获数据采用方差分析和t检验。结果糖尿病大鼠隔核GHS-R 1a表达明显低于正常大鼠（P＜0.05）。糖尿病大鼠胃运动明显减弱，胃收缩幅度（P＜0.05）和频率（P＜0.05）显著降低；隔核注射Ghrelin增强正常和糖尿病大鼠胃运动（P＜0.05），且和剂量有关。结论隔核Ghrelin在糖尿病大鼠胃运动调控中发挥重要作用。

Ghrelin；糖尿病；隔核；胃运动

随着生活水平的不断提高，肥胖的发生率也越来越高，糖尿病发病率也随之增加。糖尿病的发病机理目前还不清楚。但可以明确的是多种因素均可以导致糖尿病的发生。糖尿病的主要临床表现“三多一少”，主要特征是血糖升高。是一种由多种病因引起的慢性代谢性疾病已经成为威胁人类健康的第三大疾病。糖尿病容易导致植物神经紊乱从而导致胃张力下降，缺乏胃动力，产生胃运动障碍[1]，主要表现为胃弛缓与胃潴留，严重时可发生胃轻瘫。胃轻瘫的患者主要表现为胃动力下降，胃排空延缓；胃容纳性减弱。胃、幽门、十二指肠运动不协调。经常出现早饱、餐后上腹胀以及恶心、呕吐等症状。长期患病会导致营养不良，糖尿病并发症增加，血糖难以控制[2]。但是目前胃运动障碍的发病机制尚不明确，多认为与自主神经病变、饮食结构、肥胖、遗传因素有关[3]。胃肠运动障碍的焦点集中于脑肠肽（如Ghrelin、obestatin等）中枢机制。中枢神经系统如隔核、海马、下丘脑室旁核、弓状核在调控胃肠功能的作用。为此，我们采用免疫荧光组化、胃运动记录方法来观察糖尿病大鼠与正常大鼠胃运动的变化及隔核注射Ghrelin后对正常大鼠和糖尿病大鼠胃肠运动的刺激作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 采用健康成年Wister大鼠240只，雄性，体重220～280 g，置于室温20℃～25℃，湿度54%。昼夜循环（12h/12h）光照条件下生活，大鼠可以自由摄食和饮水。随机抽取160只大鼠来制造糖尿病大鼠模型，另外80只正常大鼠作为对照。

1.2 糖尿病大鼠模型制备 参照Wei[4]等方法向大鼠腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ）制备糖尿病胃轻瘫模型：在造模之前先为大鼠更换笼具，造模组大鼠禁食12 h，自由饮水；新鲜配制1%STZ液，40 mg/kg造模组大鼠腹腔注射，1周后造模组大鼠在进行第2次腹腔注射同等剂量1%STZ液，正常大鼠注射相应剂量的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液（pH4.41 ml/只）作为对照组。尾部静脉取血，筛选出空腹血糖＞16.7mmol/ L，同时伴有多尿、体重减轻等症状的大鼠即为造模成功。

造模成功的的糖尿病大鼠模型共有84只（52.5%），随意抽取其中14只糖尿病大鼠用于观察ghrelin受体GHS-R1a（Growth hormone secretagogue receptor 1a）在隔核的表达，剩余70只大鼠用与观察隔核注射不同剂量ghrelin后胃运动的变化。

1.3 胃运动实验 隔核埋管及核团注射:糖尿病大鼠和对照组大鼠各取14只，先禁食20～22 h，然后用100 mg/m l的硫巴比妥钠按照200 mg/kg进行腹腔注射麻醉。用牙科钻在颅骨表面钻孔，去除脑膜，参照Paxion-Watson大鼠脑图谱[5]，定位隔核（前囟1.8～0.8 mm，中线旁0～1 mm，颅骨表面下5.5～5.8 mm），将长25 mm、外径0.7 mm、内径0.4 mm的不锈钢自制套管置入隔核。颅骨表面固定一颗螺丝钉，套管用自凝牙托粉和502胶混合固定在颅骨表面的螺丝钉上，把不锈钢内芯放置在套管内以防止套管的阻塞。固定结束后，经套管用微量注射器注射1μ l滂胺天蓝，灌注固定，快速速断头取脑，在相同固定液中浸泡24 h，作系列冠状切片（40 μ m），与图谱对照观察注射套管尖端的位置，把位置不正确的去掉。

核团内微量注射：用微量注射器吸取注射药物后轻轻插入套管,其尖端伸出2 mm进入核团,缓慢注射完毕（3 min）,留针2 min。

胃应力传感器植入术:剑突下行腹正中切口，充分暴露胃，将应力传感器缝贴于胃窦浆膜面（距离幽门0.5 cm处，沿纵行肌方向），皮下把绝缘导线引至颈后部皮肤切口，穿出体外。逐层缝合，关闭腹腔。手术后每日注射青霉素2万单位（腹腔注射）。手术后3天待动物恢复正常饮食，疼痛和应激反应现象消失，即可进行实验。

大鼠胃运动记录:大鼠禁食15～20 h，不禁水。实验时大鼠硫巴比妥钠（100 mg/ml，200 mg/kg）腹腔注射麻醉。用RM-46胃运动记录仪连续描记胃运动曲线。经传感器将胃运动应力变化转为电信号，并传输给计算机处理，由记录仪软件做数据处理。

胃运动变化率的计算公式：

胃运动指数（Motility Index,MI）=5 min内胃运动曲线下面积。

1.4 荧光免疫组化染色 成年健康及糖尿病大鼠各取14只，硫巴比妥钠腹腔麻醉，参照Paxion-Watson图谱，定位隔核（同前），用微量注射器缓慢注入0.2 μ l 3%荧光金（Fluorogold，FG）。注射后饲养一周，在麻醉状态下经心灌注固定（4%多聚甲醛），快速断头取脑。参照Paxion-Watson图谱行冰冻切片(20 μ m)。切片在4%正常羊血清/0.5%TritonX-100/PBS中孵育2 h，与山羊来源抗Ghrelin（1:200）或GHS-R1a（1: 200）抗体孵育（24 h,4℃）。加入Cy3交联的兔抗羊IgG（1:100），置于黑暗湿盒内孵育2 h，用甘油/PBS封片剂封片。用荧光显微镜观察免疫阳性细胞或荧光金分布。对照组用正常羊血清代替一抗，其余步骤同前。

1.5 统计学处理 应用SPSS16.0软件，所获数据采用方差分析和t检验。

2 结果

隔核GHS-R1a受体的表达:荧光免疫组化研究显示，在正常和糖尿病大鼠GHS-R1a在隔核内均有表达，但糖尿病大鼠隔核内GHS-R1a表达明显低于正常大鼠免疫荧光强度为（9.8±2.2）/mm2和（2.7± 0.6）/mm2,P＜0.05，见图1。

图1 正常和糖尿病大鼠外侧隔核ghrelin受体GHS-R1a表达变化

图2 隔核注射Ghrelin对糖尿病大鼠胃运动的影响

与正常大鼠比较（n=10，图2A），糖尿病大鼠胃运动明显减弱（n=10，图2B），表现为胃收缩幅度（7.19±2.25）g/min vs（4.02±1.22）g/min，P＜0.05）和胃收缩频率（4.95±0.84）Hz vs（3.04±0.24）Hz，P＜0.05，图2C、D）显著降低，变化率分别为(55.87± 5.4)%和(60.53±10.1)%。

正常大鼠隔核注射不同剂量Ghrelin（0.06nmol/ L，0.6 nmol/L，6.0 nmol/L，n=10），胃运动在注射后5～10分钟开始增加，10～15 min内变化最为明显，MI变化率分别为(50.96±15.29)%、(72.43±17.05)%和(88.68±21.26)%（P＜0.05），并且和剂量呈相关性。隔核注射ghrelin受体阻断剂[D-Lys-3]-GHRP-6+ghrelin混合液,胃运动加强作用消失（P＞0.05）。

在糖尿病大鼠，隔核微量注射0.06 nmol/L ghrelin（n=10），胃运动指数虽然有增加趋势，但与正常大鼠相比无明显差异（P＞0.05）；而注射0.6 nmol/L或6.0 nmol/L ghrelin（n=10），大鼠胃运动明显增强，胃运动指数显著增加，10～15 min时变化率分别是54.35±16.32%和70.43±21.49%（P＜0.05）。隔核注射[D-Lys-3]-GHRP-6+ghrelin混合液后，促进胃运动增加作用不再出现（P＞0.05）。

3 讨论

糖尿病发病率逐年升高，绝大多数糖尿患者伴有胃运动障碍，有的甚至出现糖尿病性胃轻瘫,现在对于糖尿病胃轻瘫的研究多注重于胃肠道自身的改变和促进胃动力药物在胃肠道的作用机理的，本实验应用荧光免疫组化发现糖尿病大鼠隔核内GHSR1a表达明显低于正常大鼠（图1），同时糖尿病大鼠相对于正常大鼠胃运动功能降低（图2），提示糖尿病大鼠隔核中GHS-R1a表达减少可能会导致胃运动障碍，Yang等[6]发现GHS-R基因敲除大鼠胃排空速度减慢，肌层内神经细胞数量下降。这些研究说明了糖尿病胃运动障碍发病中GHS-R1a及其配体Ghrelin发挥重要作用，本实验研究结果于此是一致的。

Ghrelin是在1999年由Kojima等[7]发现,作为GHS-Rla体内的天然配体它包含28个氨基酸，分子量约为3.3kD。Ghrelin在体内的分布非常广泛，很多组织器官都有存在如胃、肠、腺体、垂体、下丘脑及隔核等部位[8]。在第三脑室内注射Ghrelin可使大鼠摄食量增加和胃运动作用加强[9]，而损坏Ghrelin信号通路后胃肠道运动功能明显减弱[10]。本研究在隔核内微量注射Ghrelin，观察到正常大鼠和糖尿病大鼠胃运动幅度都显著增强，并且呈与剂量具有相关性，但正常大鼠胃运动增加幅度高于糖尿病大鼠。这说明在隔核注射Ghrelin后经过某种通路可以引起胃运动增加，但是糖尿病大鼠隔核对Ghrelin反应性降低。

中枢神经系统接受外周器官传过来的机体的能量代谢的状态，并把信息传递给各个脑区，通过各脑区的协调作用，共同调控胃肠道的功能。隔核作为边缘系统的一部分，在调控机体能量代谢方面也发挥一定的作用。隔核注射去甲肾上腺素，大鼠的摄食量增加。这提示我们隔核与摄食具有相关性。本实验中隔核注射Ghrelin后胃运动增强，也证实了这一点。糖尿病大鼠隔核注射Ghrelin后胃运动增加幅度比正常大鼠降低，说明糖尿病发病过程中Ghrelin发生了改变。

隔核是边缘系统的重要组成部分，与能量平衡有一定的密切关系。隔核与脑内其他核团之间存在密切的联系，本实验仅观察到隔核注射Ghrelin后胃运动的增加，糖尿病大鼠Ghrelin反应低于正常大鼠。对于隔核与其他核团之间怎样进行协调，怎样共同调控胃肠运动的，还有待进一步研究。隔核怎样得到能量代谢的信息以及与下丘脑个各核团之间的环路也有待进一步研究。

本实验糖尿病大鼠下丘脑中Ghrelin受体GHSR1a表达减少，但是在加入受体阻断剂后胃运动明显变弱，但是对于正常大鼠加入受体阻断剂后胃肠道的运动却无显著变化，表明ghrelin在糖尿病大鼠体内调控胃肠运动作用比正常大鼠明显。Gelling等[11]的研究发现糖尿病大鼠ghrelin浓度高于正常大鼠,且脑室注射Ghrelin后可明显促进糖尿病大鼠摄食,说明ghrelin在糖尿病大鼠体重、摄食等的调控中发挥更为重要的作用，本实验与此结果是相符的。

综上，本实验研究发现糖尿病大鼠胃运动明显低于正常大鼠，边缘系统隔核内Ghrelin受体GHSR1a表达明显降低；该结果为糖尿病时胃运动调控的中枢机制以及胃运动的变化提供了新的研究角度，为下一步治疗提供了新的方法。

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The E ffect of Gh relin in Sep tum on Gastric Motility of Diabetic Gastroparesis Rats

Yan Changhong,Huo Xinghua,Liu Huix ia,Lv Kun
(Heze Medical College，Heze 274000，Shandong)

ObjectiveTo study the effect of ghrelin in septum on the gastric motility of diabetic rats.MethodsStreptozotocin was injected intraperitoneally to prepare diabetic rats.Fluorescent immunohistochemistry and realtime-PCR were used to detect the change of ghrelin receptor GHS-R1a expression.The gastric motility was evaluated by implantation of a force transducer on the surface of rat's stomachs and calculated with motility index rate.The effect of which on gastric motility was valued by central drugs injection.analysis of variance and t test.ResultsThe expression of GHS-R1a in septum of diabetic rat was lower than that of normal rats(P＜0.05).The amplitude and frequency of stomach in DM rats are lower than those in normal rats.3 the gastric motility of normal and DM rats are increased by injection of ghrelin into septum,and the effect is dose-dependent.ConclusionGhrelin in septum play an important role in the modulation of gastric motility in DM rat.

Ghrelin；Diabetic Mellitus；Septum；Gastric motility

R587.1

：A

：1008-4118（2016）01-0008-04

10.3969/j.issn.1008-4118.2016.01.004

2015-11-23