甘草黄酮抗小鼠肝纤维化药理作用的研究

吴航（菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000）

甘草黄酮抗小鼠肝纤维化药理作用的研究

吴航
（菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000）

目的探讨甘草黄酮抗肝纤维化的药理作用。方法36只昆明小鼠随机分为三组:A对照组，B模型组，C甘草黄酮预处理组。分别测定血清ALT、AST水平，肝匀浆羟脯氨酸水平，HE染色及Masson三色染色进行肝组织病理学检测。结果经过DMN诱导，模型组小鼠ALT、AST及羟脯氨酸水平明显上升，与模型组相比，甘草黄酮预处理组ALT、AST、羟脯氨酸水平明显下降。肝脏病理学检查结果显示甘草黄酮明显改善了小鼠的肝损伤以及肝纤维化的程度。结论在二甲基亚硝胺诱导的小鼠肝纤维化模型中，甘草黄酮具有明显的抗肝纤维化的药理作用。

甘草黄酮；肝纤维化；羟脯氨酸

甘草黄酮是从我国的传统中草药甘草中提取的一种脂溶性成分，甘草在中国的应用已持续一千余年。近代医学的发展过程中，早在1946年，Revers报道甘草具有抗溃疡的作用，在这之后，甘草广泛用于治疗溃疡性疾病[1]，甘草用于治疗慢性肝炎也有20余年的历史[2]，最近的研究发现甘草还具有抗冠状病毒的作用。此外，甘草还具有一些其它的药理作用，比如调节细胞增殖周期，诱导肿瘤细胞的凋亡，抗氧化和清除自由基[3]。但是甘草在治疗肝纤维化方面目前尚未有深入的研究。肝纤维化以细胞外基质增生为主要病变，大多数肝纤维化会逐渐进展成肝硬化，一旦进展成肝硬化则预后不良[4]。目前在临床上尚无特效药。因此，我们对传统中草药甘草当中的活性成分甘草黄酮对肝纤维化的保护作用进行了实验。现报道如下。

1 临床材料

1.1 动物与试剂 昆明雄性小鼠36只，体重20～35 g，甘草黄酮购自上海融合科技有限公司，二甲基亚硝胺（DMN）购自天津化学试剂有限公司，谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、羟脯氨酸（HYP）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 动物分组及造模方法 所有昆明雄性小鼠随机分为3组：（A）正常对照组。（B）肝纤维化模型……（C）甘草黄酮预处理组。B、C组动物腹腔注射二甲基亚硝胺8 mg/kg（2m l/kg），A组腹腔注射同容量生理盐水，每周三次，给药三周。C组灌胃给予甘草总黄酮悬浮液15 mg/kg（0.1 ml/10 g），A、B组灌胃给予同容量生理盐水，从造模开始时同时给药，每天一次，连续给药6周。

最后一次给药结束后禁食24 h，门静脉取血，留取肝脏标本。静脉血离心取血清，肝脏标本根据不同的检测手段保存在不同的环境下，病理标本固定于4%多聚甲醛溶液中，进行HE染色以及Masson三色染色。用于匀浆的标本保存在-40℃冰箱中。

1.3 生化指标测定 按照试剂盒说明书测定血清ALT、AST、以及肝脏匀浆当中羟脯氨酸水平。

1.4 统计学处理 所获有数据采用方差分析和t检验。

2 结果

2.1 甘草黄酮对AST和ALT的影响 ALT和AST是衡量肝损伤的重要指标，正常情况下，这两种酶存在于细胞质中，当肝损伤时，细胞膜通透性升高，ALT、AST释放入血，使外周血ALT和AST的水平上升。与正常对照组相比，模型组动物血清中的ALT含量上升了9.35倍(P＜0.01)，AST含量上升3.83倍（P＜0.01），充分说明了DMN引起肝细胞损伤。与模型组相比，甘草黄酮预处理组的动物血清中的ALT含量下降25%（P＜0.05），AST下降27%（P＜0.01），表明甘草黄酮具有改善DMN引起的肝脏损伤的作用。（表1、图1）。

表1 不同组别小鼠ALT、AST水平的比较?

表1 不同组别小鼠ALT、AST水平的比较?

注：与正常对照组相比**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 样本数(只) ALT(IU/L) AST(IU/L) A正常对照组 12 7.21±2.91 18.33±4.84 B模型组 12 67.47±15.03** 70.32±14.29**C甘草黄酮预处理组 12 50.46±15.33# 51.06±13.11##

图1 丹参酚酸B对ALT、AST的影响与A组相比，**P＜0.01；与B组相比，#P＜0.05

2.2 甘草黄酮对肝组织羟脯氨酸含量的影响 羟脯氨酸（HYP）是衡量肝纤维化程度的一个重要的生化指标，它是在结缔组织中特异性存在的一种氨基酸，当肝纤维化发生时，细胞外基质、胶原等结缔组织增多，肝组织匀浆中的羟脯氨酸含量增加。与正常组相比，模型组羟脯氨酸含量明显上升（P＜0.01），经过甘草黄酮预处理后，与模型组相比，肝脏中羟脯氨酸含量明显下降（P＜0.05）。（表2、图2）

表2.丹参酚酸对羟脯氨酸水平的影响 ?

表2.丹参酚酸对羟脯氨酸水平的影响 ?

注：与正常对照组相比*P＜0.01，与模型组相比#P＜0.05。

组别 样本数(只) 羟脯氨酸(μ g/g肝湿重) A正常对照组 12 185.2±15.3 B模型组 12 317.6±26.4**C甘草黄酮预处理组 12 248.6±38.2#

图2 甘草黄酮对HYP的影响与A组相比，**P＜0.01,#P＜0.05

2.3 甘草黄酮对大鼠肝组织形态学的影响

2.3.1 肝脏大体标本 大体标本观察可见，正常对照组动物肝脏形态正常，腹腔内无腹水，肝脏呈鲜红色，肝缘锐利，质软，肝脏大小正常，表面无颗粒和结节。模型组动物肝脏呈暗红色，肝缘变钝，质韧，可见中等量腹水，少部分动物肝脏体积减小，表面呈颗粒状改变，部分动物肠道淤血肿胀，提示门脉压增高，肝纤维化程度较严重。甘草黄酮预处理组动物肝脏呈鲜红色，肝缘锐利，质软，肝脏大小正常，表面可见少量颗粒状改变，与动物模型相比损伤程度较轻。

2.3.2 HE染色 正常对照组肝细胞排列规则，汇管区结构以及肝小叶结构正常。模型组动物可见肝细胞排列紊乱，肝小叶正常结构消失，同时伴有炎性细胞渗出，汇管区和肝血窦淤血现象严重，DMN动物肝脏已经出现明显的损伤。甘草黄酮预处理组HE染色可见肝脏结构大致正常，仅仅在镜下观察到极少量炎性细胞渗出以及汇管区轻微淤血。

B:模型组

C:甘草黄酮预处理组

A:正常对照组

B:模型组

C:甘草黄酮预处理组

2.3.3 Masson三色染色Masson染色下，胶原为蓝色，胞质为红色，根据胶原增生程度可判断肝脏肝纤维化的水平。正常对照组几乎没有胶原增生，没有观察到肝纤维化的表现。模型组在Masson染色下可见大量蓝色的纤维间隔形成，提示动物在DMN诱导下已经出现明显的肝纤维化。甘草黄酮预处理组可见极少量纤维间隔，但尚未破坏肝小叶结构。

3 讨论

二甲基亚硝胺经过肝脏代谢之后可以产生甲醛，从而对人或动物的肝细胞产生毒性作用[5]。此外在DMN的代谢过程中会产生大量的氧自由基，导致肝细胞的严重损伤并且激活肝纤维化发生过程中的关键细胞—肝脏星形细胞[6]。肝脏星形细胞一旦被激活就可以产生细胞外基质，在肝脏中形成大量纤维间隔从而破坏肝小叶结构，导致肝纤维化并且加速肝纤维化向肝硬化进展[7]。在本实验中，长期小剂量给予DMN导致肝纤维化的形成。同时由于DMN对于正常肝细胞的毒性作用，使细胞膜通透性增加，大量ALT、AST释放入血，使小鼠血液中ALT、AST水平明显上升。而在甘草黄酮预处理组则观察到小鼠血液中ALT和AST的水平明显下降，以上结果证实了甘草黄酮对于DMN造成的肝脏损伤具有很强的保护作用。

羟脯氨酸是一种在增生的肝脏纤维间隔中特异性表达的氨基酸。在肝纤维化的发生过程中，由于肝脏星形细胞激活导致大量纤维间隔增生，所以羟脯氨酸的水平明显上升。因此，肝脏中羟脯氨酸的含量可以反映出肝纤维化的程度[8]。小鼠肝脏中羟脯氨酸含量明显上升。而在甘草黄酮能使羟脯氨酸的含量明显降低。小鼠肝纤维化的进展速度明显受到了抑制。同时，肝脏HE染色证实甘草黄酮预处理组的小鼠肝脏损伤程度相对于模型组小鼠呈现出明显的下降趋势。而Masson三色染色显示经过甘草黄酮的预处理之后，相对于模型组小鼠，甘草黄酮预处理组小鼠肝纤维化的程度也明显减轻。

[1] 中村理惠,廖系晗.甘草的抗溃疡作用机理研究[J].重庆中草药研究,2004，(1):49-52.

[2] 王崇慧,郑三菊.异甘草酸镁与复方甘草酸苷治疗慢性肝炎的疗效比较[J].临床消化病杂，2013,25(4):203-205.

[3] Scarpato R,Paganucci L，Bertoli et,al.Licoflavone Cattenuates the genotoxicity of cancer drugs in human peripheral lymphocytes[J]. Phytother Re，2008，22(12):1650-1654.

[4] Primignani M,Tosetti G Lamura.Therapeutic and clinical aspects of portal vein thrombosis in patients with cirrhosis[J].World J Hepatol，2015，7(29):2906-2912.

[5] Ahmad A,Ahmad R.Resveratrol mitigate structural changes and hepatic stellate cell activation in N'-nitrosodimethylamine-induced liver fibrosis via restraining oxidative damage[J].Chem Biol Interact，2014，25;221:1-12.

[6] Lu L,Wang J Lu H et,al.MicroRNA-130a and-130b enhance activation of hepatic stellate cells?by suppressing PPARγ expression: A rat fibrosis model study[J].Biochem Biophys Res Commun,2015, 25:465(3):387-393.

[7] Li Y,Kim BG,Qian s,et,al.Hepatic Stellate Cells Inhibit T Cells through Active TGF-β 1 from a Cell Surface-Bound Latent TGF-β 1/GARP Complex[J].Immunol.2015 Sep 15;195(6):2648-2656.

[8] Zhang L,Ji YX,Jiang WL,et,al.Protective roles of pulmonary rehabilitation mixture in experimental pulmonary fibrosis in vitro and in vivo [J].Braz J Med Biol Res,2015,48(6):545-552.

The Pharm acological Activity of Licoflavone Anti Liver Fibrosis in mice

Wu Hang
（Heze Medical College,Heze 274000,Shandong）

ObjectiveTo explore the anti-liver fibrosis effect of licoflavone.Methods 36 Kunming mice were divided into three groups random ly:(A)control group(B)fibrosis group(C)Licoflavone pretreatment group.Determine the serum level of ALT and AST,liver homogenate level of hydroxyproline.HE staining and Masson trichromatic staining were used to determine liver tissue.ResultsThe levels of ALT,AST and hydroxyproline were significantly rised by DMN.Compared with fibrosis group,ALT,AST and hydroxyproline levels of licoflavone pretreatment group were significantly reduced.Liver pathology examination results show that licoflavone obviously attenuated the liver injury of mice and the degree of liver fibrosis.ConclusionLicoflavone showed obvious anti-liver fibrosis pharmacological effect in mice induced by DMN.

Licoflavone;Liver fibrosis;Hydroxyproline

R572.2

：A

：1008-4118（2016）01-0011-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2016.01.005

2015-12-19