奶牛乳腺炎主要病原菌PCR检测方法

武守艳，韩一超，陈剑波，杨丽华，董春光，韩文儒，夏艳婷

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032）

奶牛乳腺炎主要病原菌PCR检测方法

武守艳，韩一超，陈剑波，杨丽华，董春光，韩文儒，夏艳婷

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032）

针对引起奶牛乳腺炎的3种主要病原菌无乳链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌设计了3对特异性引物，通过对单一细菌PCR扩增条件的优化、特异性和敏感性研究，确立了对这3种病原菌特异、敏感、快速的PCR鉴定和检测方法，为进一步建立奶牛乳腺炎主要病原菌多重PCR诊断方法奠定了基础。

奶牛乳腺炎；主要病原菌；PCR；金黄色葡萄球菌；无乳链球菌；大肠杆菌

奶牛乳腺炎是危害奶牛业的一种世界性疾病，此病的发生是由于乳腺受到直接物理、化学的刺激、病原微生物的侵袭及饲养管理不当引起的炎性变化[1]。由于它的发病原因比较复杂，给防治带来很大困难，该病危害严重，不仅会降低奶牛的产奶量和牛奶品质，同时牛奶中的细菌毒素还会影响人体健康。

据调查，近年来山西省某些奶牛场引起奶牛乳腺炎的主要病原菌有乳房链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和洋葱伯克霍尔德菌等[2]，且在临床上以不表现症状的隐性型多见，感染的细菌种类也较多。因而，在临床诊断和病原菌鉴定方面有很大的困难；尽管目前国内外对临床采集的样品中病原菌的检验，大部分仍采用所谓的“金标准”（细菌培养）法，即采集标本后，先接种增菌培养液增菌，再分离单个菌落进行细菌鉴定，该方法虽然比较准确，但是诊断过程耗时较长且敏感性较低，细菌培养易受其生理条件和抗生素使用的限制，故难以满足临床需求[3-4]。随着分子生物学技术的发展，PCR技术在病原菌的检测方面得到了广泛的应用，并且展现出快速、特异的优势和前景[5]。

本研究在对山西省奶牛乳腺炎流行病学调查研究的基础上，针对引起奶牛乳腺炎的3种主要病原菌无乳链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌设计了3对特异性引物，通过对PCR扩增条件的优化、特异性和敏感性研究，建立了对这3种病原菌的快速、敏感、特异的PCR检测和鉴定方法，从而为进一步建立奶牛乳腺炎主要病原菌多重PCR诊断方法奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 菌株

供试标准菌株无乳链球菌（CCM55934）、金黄色葡萄球菌（ATCC29062）、大肠杆菌（ATCC12079）以及对照标准菌株沙门氏菌（CCM3572）均购自中国兽药监察所；被检菌株是从奶样中分离并鉴定的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌，均由山西省农业科学院畜牧兽医研究所奶牛乳腺炎快速诊断技术研究课题组分离保存。

1.2 主要仪器及试剂

主要仪器有分析天平、台式高速离心机、水浴锅、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、超净台、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、微波炉、-20℃冰箱、可调移液器（2，20，200，1 000 μL），均由山西省农业科学院畜牧兽医研究所兽医临床医学研究室提供。

主要试剂有10×PCR buffer、琼脂糖、rTaqDNA聚合酶、Marker、饱和酚、dNTPs及其他试剂，均购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司。

1.3 引物设计

根据GenBank已发表的编码16S～23S rRNA的DNA序列设计引物，经比对后确定引物具有良好的特异性，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如表1所示。

表1 病原菌PCR引物设计结果

1.4 细菌DNA提取

将3种细菌菌株分别接种于LB液体培养基中，于37℃培养过夜；然后将菌液于5 000 r/min（4℃）离心后弃上清，将残余液滴吸干净后，加入500 μL TE（10 mmol/LTris HCl，0.5 mmol/LEDTA，pH值8.0），加30 μL 10%SDS和3 μL 10 mg/mL的蛋白酶K；55℃温育1 h；加入等体积的酚、氯仿、异丙醇混匀，5 000 r/min离心10 min，弃上清后加入等体积的氯仿、异丙醇混匀，5 000 r/min离心10 min，弃上清后加入1/10体积的3 mol/L的乙酸钠（pH值5.2）和核糖核酸酶A，37℃下轻摇30 min后加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置2 h，10 000 r/min离心15 min弃上清，再用70%乙醇洗涤2次，超净台内风干沉淀，重新溶于50 μL TE中，-20℃保存备用。

1.5 PCR条件的优化

用普通PCR方法分别对大肠杆菌（ATCC12079）、无乳链球菌（CCM55934）、金黄色葡萄球菌（ATCC29062）检测，依次对退火温度、引物浓度、dNTP浓度等条件进行优化探索，以便提高PCR扩增效果。同时进行细菌PCR特异性和敏感性试验，反应体系均为20 μL。

1.63 种细菌单重PCR方法的特异性试验

将试验用标准菌株、被检菌株及对照菌株分别在培养基上增菌后按1.4方法提取细菌DNA，制备模板，然后按优化后的PCR扩增条件进行扩增，以确定细菌PCR方法的特异性。

1.73 种细菌单重PCR的灵敏性试验

将3种病原菌接种于相应的液体培养基中，37℃振摇培养18～24 h[6]，于OD600测菌体浓度，使菌液倍比稀释成10～107的数量级。同时将不同稀释浓度的菌液按1.4方法提取细菌DNA，制备模板，按优化后的条件进行PCR扩增，根据cfu浓度与扩增结果的比对，确定各病原菌PCR方法的灵敏性。

1.8 电泳检测

称4 g琼脂糖放于500 mL锥形瓶中，加入50倍稀释的TAE电泳缓冲液200 mL，于微波炉中熔解，再加入10 μL染色液混匀，配制成2%的琼脂糖凝胶。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物5 μL混合1 μL上样缓冲液，点样于琼脂糖凝胶孔中，以110～120 V电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察记录结果。

2 结果与分析

2.1 PCR退火温度的优化试验结果

在普通PCR方法的基础上分别以3种代表菌株进行PCR扩增的退火温度条件的优化试验。结果表明，无乳链球菌菌株退火温度在47.5～57.5℃均可扩增出相应条带，以49.0～55.0℃扩增效果最佳；金黄色葡萄球菌菌株退火温度在49.5～59.0℃均可，以55.5～57.5℃扩增效果最佳；大肠杆菌菌株的退火温度在45.5～60.5℃均可，以46.0～53.5℃扩增较为理想（图1～3）。

2.2 PCR扩增引物浓度的优化试验结果

将无乳链球菌和金黄色葡萄球菌引物终浓度在0.25～2.75μmol/L、大肠杆菌在0.125～1.5μmol/L稀释成共10个稀释度。利用优化后的退火温度分别对3种病原菌PCR扩增的引物浓度进行优化，结果表明，无乳链球菌的引物终浓度在1.25～2.75 μmol/L均可，以1.5～1.75 μmol/L效果为佳；金黄色葡萄球菌引物终浓度在1.0～2.75 μmol/L均可，以1.25～2.0 μmol/L效果为好；大肠杆菌的引物终浓度在0.5～1.5 μmol/L均可，以0.75～1.0 μmol/L效果为佳（图4～6）。

2.3 PCR扩增dNTP浓度的优化试验结果

试验将dNTP终浓度设为0.025～0.275 mmol/L共11个梯度，利用优化后的退火温度和引物浓度分别以3种代表菌株进行PCR扩增的dNTP浓度优化。结果表明，扩增无乳链球菌时，dNTP终浓度在0.075～0.2 mmol/L均可，以0.1～0.2 mmol/L为佳；扩增金黄色葡萄球菌时，dNTP终浓度以0.1～0.2 mmol/L为适宜，0.125～0.175 mmol/L为最佳；扩增大肠杆菌时，dNTP终浓度在0.075～0.275 mmol/L均可（图7～9）。

2.4 PCR扩增特异性试验结果

将3种标准菌株和从临床乳腺炎牛奶样品中分离鉴定的同种菌株以及试验中的对照菌，按照优化后的PCR扩增条件，分别以自身的引物进行单重PCR扩增，结果表明，在162，439，544 bp处出现了与试验设计相符的扩增片段，对照菌未出现扩增片段（图10）。

2.5 PCR扩增的敏感性试验结果

将不同稀释浓度的菌液提取细菌DNA，制备模板后，按照优化后的条件进行PCR扩增，结果表明，无乳链球菌扩增的灵敏性为104cfu/mL，金黄色葡萄球菌扩增的灵敏性为105cfu/mL，大肠杆菌的灵敏性为103cfu/mL（图11～13）。

3 讨论

长期以来，奶牛乳腺炎一直困扰着奶牛业的发展，奶牛乳腺炎的研究也成为世界性的热点，无论在预防、治疗及诊断方面都做了大量的工作，尤其是对奶牛乳腺炎的诊断、检测方法的研究更是如此，常用的对奶牛乳腺炎的诊断方法有病原微生物检查法、乳汁体细胞检查法、乳汁pH值检查法及乳汁导电性检查法等，这些方法都可以作为初步诊断，但是进一步确诊需要进行病原微生物的分离和鉴定[1]。病原微生物分离和鉴定尽管较为准确，但敏感性较低和耗时较长，再者对于隐性乳腺炎病料的细菌培养常出现假阴性[7]；PCR技术的应用弥补了细菌学培养的不足，该技术在病原菌的诊断上极大地节省了时间，在数小时内就可以检测出来，尤其是建立多重PCR方法后既能节省试剂的用量又能缩短检测时间[8]。

本试验中细菌的引物设计选择在16S～23S rRNA区间，因为这个区间是一个非功能性的保守区间[9]，也越来越多的被用来鉴别种属关系较近的细菌，选用16S～23S rRNA区间进行引物的设计，可以较好地鉴别出种属进化关系较近的细菌[10]。以此为依据，设计出相应的主要病原菌PCR扩增引物，通过试验研究证实了这3对引物既具有良好的代表性，又具有良好的特异性。

本试验为了便于观察结果，在引物的设计上遵循使得3对引物扩增的核酸片段长度呈梯度出现的原则，设计为不同大小，即无乳链球菌162 bp、金黄色葡萄球菌439 bp和大肠杆菌544 bp，这样使得结果判定更加直观、简便和实用，同时也为多重PCR检测和鉴定方法的建立奠定了一定的基础，通过对退火温度、引物浓度、dNTP浓度等条件的优化，及病原菌PCR扩增的特异性、敏感性研究，验证了该方法具有快速、特异性强的优点，可以用于对引起奶牛乳腺炎的这3种主要病原体的检测和鉴定。

［1］肖定汉.奶牛病学[M].北京：中国农业大学出版社，2002：208-223.

［2］武守艳，韩一超，陈剑波，等.山西省奶牛乳腺炎病原菌调查研究[J].中国奶牛，2013（16）：28-30.

［3］Lenoard J，Lascdea S R，Dryyia D.Quanlitation of bacteria in cerebrospinal fluid and blood of children and its diagnostic significance[J].J Clin Microbiol，1984，19（2）：187.

［4］Teng K，Li M，Yu W，et al.Comparison of PCR with culture for detection of ureaplasma urealylicum in clinical samples from patients with urogeneited infections[J].J Clin Microbiol，1994，32（9）：2232.

［5］布日额，郎景民，华育平，等.牛乳中无乳链球菌PCR快速检测方法的建立[J].中国奶牛，2009（8）：17.

［6］曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术[M].北京：北京农业大学出版社，1991：120-158．

［7］Phuektes P，Mansell P D，Browning G F.Mutiplex polymerase chain reaction assay for simultaneous detection of Staphylococcus aureus and Streptococcal causes of bovine mastitis[J].J Dairy Sci，2001，84：1140-1148.

［8］张善瑞，王长发，高运东，等.应用PCR方法检测奶牛乳房炎主要病原菌[J].家畜生态学报，2007，28（4）：78.

［9］Barry T，Colleran G，Glennon M，et al.The 16s/23s ribosomal spacer region as a target for DNA probes to identify Eubacteria[J].PCR Methods Appl，1991，1：51-56.

［10］Ludwig W，Schleifer K H.Bacterial phylogeny based on 16s and 23s rRNA sequence analysis[J].FEMS microbial Rev，1994，15：155-173.

Study on PCR Method for the Detection of the Pathogenic Bacteria of Dairy Mastitis

WU Shou-yan，HAN Yi-chao，CHEN Jian-bo，YANG Li-hua，DONG Chun-guang，HAN Wen-ru，XIA Yan-ting
（Institute of Animal Husbandry&Veterinary，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030032，China）

According to 3 kinds of main pathogenic bacteria of dairy mastitis—Streptococcus agalactiae,Staphylococcus aureus and Escherichia coli,3 pairs of specific primers were designed,PCR conditions of of single bacteria was optimized,specificity and sensitivity of PCR detection method were researched.A rapid,sensitive,specific PCR method for 3 kinds of main pathogenic bacteria was established,which lay a foundation for further establishment of the main pathogenic bacteria of dairy cow mastitis diagnosis of multi PCR method.

dairy mastitis;main pathogenic bacteria;PCR;Streptococcus agalactiae;Staphylococcus aureus;Escherichia coli

S858.237.2＋6

A

1002-2481（2016）02-0232-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.02.26

2015-10-16

山西省科技攻关项目（20100311045，20150311017-3）；山西省农业科学院重点项目（YZD1514）

武守艳（1969-），女，山西盂县人，副研究员，主要从事兽医临床医学科学研究工作。韩一超为通信作者。