泰妙菌素生产菌种原生质体制备条件优化

杨 智， 孙金刚， 牛 春， 张 萍

(宁夏泰瑞制药股份有限公司，宁夏银川 750101)

泰妙菌素生产菌种原生质体制备条件优化

杨 智， 孙金刚， 牛 春， 张 萍

(宁夏泰瑞制药股份有限公司，宁夏银川 750101)

[目的]探讨泰妙菌素生产菌种原生质体的最优制备方法。[方法]通过对原生质体制备条件进行优化，建立泰妙生产菌种原生质体制备体系。[结果]优化后制备条件：以培养3 d的菌丝体为材料，将其置于含质量浓度0.10%溶壁酶、0.60 mol/L MgSO4的酶液中，25 ℃酶解3.0～3.5 h，将酶解液用G2砂芯漏斗过滤，滤液即为原生质体悬液。采用该方法，泰妙生产菌种原生质体制备率达1.5×106个/mL。[结论]试验结果为提高泰妙菌素生产菌种的产量提供了理论依据。

泰妙菌素;原生质体;溶壁酶

延胡索酸泰妙菌素是新型兽用抗生素，对支原体及部分革兰氏阳性菌有良好的抗菌活性[1]，主要用于防治猪支原体肺炎、猪密螺旋体痢疾、鸡慢性呼吸道疾病。该菌种遗传背景资料较少，目前常采用诱变的手段进行育种研究。原生质体是诱变试验的良好材料，对射线和化学诱变剂敏感，有利于提高突变率。笔者研究了泰妙菌素生产菌种原生质体(以下简称泰妙原生质体)的制备方法，以期为提高泰妙生产菌种的产量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌。泰妙菌素生产菌(Clitopilusprunulus)TMII14-28由宁夏泰瑞制药股份有限公司菌种研究室保藏。

1.1.2 主要试剂。葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、琼脂、溶壁酶(上海蓝季科技发展有限公司)、蜗牛酶(上海华蓝化学科技有限公司)、纤维素酶。

1.1.3 主要仪器。LDZX-75KBS立式蒸汽压力灭菌器(上海申安医疗器械厂)、YT-CJ-2N双人双面净化工作台(北京亚泰科隆仪器技术有限公司)、HZQ-F280全温振荡培养箱(江苏省太仓市华美生化仪器厂)、PSX智能型恒温恒湿培养箱(浙江省宁波莱福科技有限公司)。

1.1.4 培养基。斜面培养基：马铃薯(浸提液)200 mg/g，葡萄糖20 mg/g，琼脂20 mg/g，pH 6.50。种子瓶培养基：马铃薯(浸提液)200 mg/g，葡萄糖20 mg/g，pH 6.50。

1.2 方法

1.2.1 菌丝体的培养。取斜面培养基上3 cm2菌丝体置于组织研磨器中，充分研磨至无片状菌丝，将菌悬液接种到种子瓶培养基中，25 ℃、220 r/min振荡培养3 d。

1.2.2 渗透液的配制。以磷酸盐缓冲液(pH 6.86)为溶剂，配制终浓度为0.60 mol/L的MgSO4作为渗透液。

1.2.3 酶液的配制。以渗透液为溶剂配制终质量浓度为0.10%的溶壁酶溶液，用0.45 μm滤膜过滤除菌，现用现配。

1.2.4 原生质体的制备。取20 mL培养3 d的种子液，3 000 r/min离心10 min，收集菌丝。将20 mL过滤除菌的酶液加入到上述菌丝中，25 ℃酶解3.0～3.5 h，期间每隔0.5 h振荡混匀1次，最后用G2砂芯漏斗过滤，收集滤液。用渗透液稀释后，血球计数板计数。

1.2.5 泰妙菌种对数生长期的确定试验。将处于对数生长期中期的菌丝制备成原生质体，其复苏率最高，所以试验首先是确定泰妙菌丝体的对数生长期。以泰妙斜面菌丝为材料，接种36瓶，每隔12 h测定1次菌丝浓度，绘制生长曲线，确定菌种的对数生长期。

1.2.6 工作酶类型的确定试验。选择纤维素酶、蜗牛酶、溶壁酶以及这3种酶的两两组合，作为工作酶。酶质量浓度均为0.10%，pH为6.80，温度为25 ℃，酶解时间为4.0 h，渗透液为0.60 mol/L MgSO4。期间每隔0.5 h振荡混匀1次，最后显微镜观察菌丝水解情况。显微镜放大倍数为10×100。

1.2.7 渗透液浓度的确定试验。用MgSO4配制不同浓度的渗透液，筛选适合泰妙原生质体的渗透液浓度。

1.2.8 原生质体分离方法的确定试验。选择4种方法，筛选适合泰妙菌种的原生质体分离方法，分别是：①将制备好的原生质体悬液500 r/min离心10 min，收集沉淀；②将制备好的原生质体悬液3 000 r/min离心10 min，收集沉淀；③将制备好的原生质体悬液3 000 r/min离心10 min，收集沉淀，用等量渗透液完全溶解沉淀，重复离心，再收集沉淀，即用渗透液清洗1次沉淀，去除残留的工作酶；④将制备好的原生质体悬液用G2砂芯漏斗过滤，收集滤液。处理后显微镜观察，显微镜放大倍数为10×100。

1.2.9 酶解时间的确定试验。以0.5～4.0 h为酶解时间，每隔0.5 h取样1次，观察结果，确定酶解时间。酶质量浓度为0.04%，渗透液浓度为0.60 mol/L，溶壁酶浓度为0.10%，pH 6.80，温度为25 ℃。

1.2.10 酶浓度的确定试验。为提高原生质体得率，对溶壁酶质量浓度进行优化，设计0.04%、0.10%、1.00%共3个梯度。其他条件：pH 6.80，温度为25℃，渗透液为0.60 mol/L MgSO4，酶解时间为3.0～3.5 h。1.2.11 优化条件验证试验。对上述结果进行验证，泰妙原生质体制备条件：工作酶为溶壁酶，质量浓度为0.10%；渗透液为0.60 mol/L MgSO4；pH 6.80；温度 25 ℃；酶解时间3.0～3.5 h；分离方法为G2砂芯漏斗过滤。通过血球计数板计数。2 结果与分析

2.1 泰妙菌种对数生长期的确定 由图1可知，泰妙生产菌种的对数生长期为接种后46～103 h，选择72 h，即处于对数生长期中期的菌丝为材料，制备原生质体。

2.2 工作酶类型的确定 结果显示，只有单独使用溶壁酶能获得泰妙原生质体，获得的原生质体数量为1.2×105个，所以将溶壁酶作为工作酶。溶壁酶与其他2种酶组合时，未获得原生质体，是因为试验使用的蜗牛酶和纤维素酶均为复合酶，其含有的蛋白酶将溶壁酶分解，使溶壁酶失去活性。单独使用溶壁酶的酶解效果较好，这与陈鹏等[2]、张炳炽[3]、Hongg[4]、Cheng等[5]的研究结果一致。

2.3 渗透液浓度的确定 泰妙原生质体失去了细胞壁的保护，由于胞内为高渗状态，很容易吸水从而导致细胞破裂。因此，制备原生质体时需要环境提供合适的渗透压力，以保证原生质体的完整，防止细胞死亡。

图1 泰妙菌种生长曲线Fig.1 The growth curve of Tiamulin production strains

结果表明：以0.55～0.80 mol/L MgSO4作为渗透液，均可以获得再生单菌落，其中在0.60 mol/L 浓度下再生的单菌落数量最多，为21，所以选择0.60 mol/L MgSO4作为渗透液。

2.4 原生质体分离方法的确定 结果表明，G2砂芯漏斗过滤法是可行的泰妙原生质体分离方法(图2)。500 r/min离心10 min，离心力小，不能达到分离的目的，该方法甚至未获得固形物，所以不适合泰妙原生质体的分离。3 000 r/min离心10 min获得固形物，但没有观察到原生质体，可能是因为离心过程中原生质体破碎。

注：a.500 r/min离心10 min；b.3 000 r/min离心10 min;c.3 000 r/min离心10 min，渗透液清洗1次；d.G2砂芯漏斗过滤。Note:a.500 r/min centrifuge for 10 min；b.3 000 r/min centrifuge for 10 min;c.3 000 r/min centrifuge for 10 min，and cleaning penetrant for one time;d.Filtering by G2 sand core funnel.图2 原生质体分离显微镜观察结果Fig.2 Microscope observation result of protoplast separation

2.5 酶解时间的确定 由图3可知，当酶解时间在3.0～3.5 h，反应趋于平衡，且有大量原生质体释放到渗透液中，再生的单菌落数量符合试验要求。因此，酶解时间确定为3.0～3.5 h。2.6 酶质量浓度的确定 由图4可知，3个质量浓度条件下，均能观察到原生质体，其中在0.10%和1.00%质量浓度条件下，原生质体数量较多。考虑到试验成本，确定溶壁酶质量浓度为0.10%。

图3 酶解时间试验结果Fig.3 Result of enzymatic hydrolysis time experiment

2.7 优化条件验证 结果表明，采用该方法制备的原生质体浓度为1.5×106个/mL。该研究建立的泰妙原生质体制备体系高效、可靠，能够清晰地观察到原生质体(图5)，与文献报道一致[6]。

3 结论与讨论

通过对泰妙原生质体制备过程中各个步骤进行优化，最终确定：①菌丝体。采用种瓶培养3 d的菌丝，取20 mL菌丝体于无菌离心管中，3 000 r/min离心10 min，收集沉淀。②酶液。酶液为质量浓度0.10%溶壁酶、0.60 mol/L MgSO4，用磷酸盐缓冲液(pH 6.86)溶解，配制好后用0.45 μm滤芯过滤除菌。 ③酶解条件。向上述菌丝体加入20 mL酶液，25 ℃酶解3.0～3.5 h，期间每隔0.5 h振荡混匀1次。④原生质体分离方法。采用G2砂芯漏斗过滤分离。采用该方法制备的泰妙原生质体浓度为1.5×106个/mL。

注：a.0.04%溶壁酶;b.0.10%溶壁酶;c.1.00%溶壁酶。 Note:a.0.04% dissolve enzyme;b.0.10% dissolve enzyme;c.1.00% dissolve enzyme.图4 溶壁酶质量浓度试验显微镜观察结果Fig.4 Microscope observation result of dissolve enzyme concentration experiment

图5 原生质体显微镜观察结果Fig.5 Microscope observation result of protoplast

该研究采用对数生长期中期的菌丝体为材料，开展原生质体制备试验。对数期的菌丝细胞壁薄且成分相对简单，有利于酶解反应的进行[7]。采用伞菌科真菌制备原生质体时，广泛使用的溶壁酶为工作酶[3,7-8]。溶壁酶为复合型酶，具有β-葡聚糖酶、几丁质酶、蛋白酶活性[7-8]，能有效破除泰妙菌丝细胞壁。该研究通过浓度梯度试验，确定渗透液浓度为0.60 mol/L。合适的渗透液浓度有利于原生质体的稳定及得率的提高[7]。

[1] 黄贺贤,曾振灵,黄显会.截短侧耳素类抗生素——泰妙菌素的研究进展[J].中国兽药杂志,2010,44(6):42-45.

[2] 陈鹏,郭成金.金针菇原生质体制备和再生探究[J].江苏农业科学,2014,42(9):200-204.

[3] 张炳炽.金针菇原生质体制备和再生条件实验[J].山东师范大学学报(自然科学版)，1990,5(3):74-77.

[4] HONGG S W.Formation and regeneration of protoplasm inLentinusedodes[J].Mushroom newsletter for the tropics,1988，5(4):1-3.

[5] CHENG Y,BÉLANGER R R.Protoplast preparation and regeneration from spores of the biocontrol fungusPseudozymaflocculosa[J].FEMS Microbiology Letters,2000,190(2):287-291.

[6] 董汪洋,王郑隆，杨云乔，等.杏鲍菇的菌株筛选与原生质体制备条件优化[J].浙江农业学报，2015，27(5):782-786.

[7] 王鑫,车振明，黄韬睿.原生质体融合技术在微生物菌种选育中的应用[J].食品研究与开发，2008，29(10):174-176.

[8] 李艳丽.原生质体技术筛选刺芹侧耳高产多糖和漆酶菌株的研究[D].长春：吉林农业大学，2012.

Optimization on Protoplast Preparation Conditions of Tiamulin Producing Strain

YANG Zhi, SUN Jin-gang, NIU Chun et al

(Ningxia Tairui Pharmaceutical Company Co., Ltd.,Yinchuan,Ningxia 750101)

[Objective] The aim was to explore the optimal protoplast preparation method of Tiamulin producing strain.[Method] We established a system for protoplast preparation of Tiamulin producing strain by optimizing protoplast preparation conditions. [Result] The opotimal conditions were as followed:used 3 days cultured mycelium as material;put it into a solution which contain 0.10% lyticase, 0.60 mol/L MgSO4; hydrolyzed the mycelium with enzyme under 25 ℃ for 3.0-3.5 hours, then filtered the solution with G2 sintered discs;the filter liquor was protoplast suspension. By using this method, the protoplast preparation rate of Tiamulin producing strain could reach 1.5×106per milliliter.[Conclusion] The results provide theoretical basis for the improvement of Tiamulin producing strain.

Tiamulin;Protoplast;Lyticase

杨智(1987- )，男，宁夏石嘴山人，助理工程师，硕士，从事分子生物学研究。

2016-09-28

S 859.79+6

A

0517-6611(2016)35-0005-03