不同培养基对黑木耳锁状联合菌丝比率的影响

王 妍，杜春梅，2，姜忠元，董锡文，2*

(1.佳木斯大学生命科学学院,黑龙江佳木斯 154007；2.佳木斯大学微生物研究所，黑龙江佳木斯 154007；3.佳木斯大学教务处，黑龙江佳木斯 154007)

不同培养基对黑木耳锁状联合菌丝比率的影响

王 妍1，杜春梅1，2，姜忠元3，董锡文1，2*

(1.佳木斯大学生命科学学院,黑龙江佳木斯 154007；2.佳木斯大学微生物研究所，黑龙江佳木斯 154007；3.佳木斯大学教务处，黑龙江佳木斯 154007)

[目的]研究培养基中葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸对黑木耳锁状联合菌丝比率的影响。[方法]采用平板插片培养方法，以黑木耳H29为试验材料，通过单因素试验确定葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸对锁状联合菌丝比率促进的最佳浓度。再通过正交试验确定其最佳组合。[结果]适当浓度的葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸均能提高H29锁状联合菌丝比率，其最佳组合为20 mg/mL葡萄糖、6 mg/mL蛋白胨、3.5 mg/mL丙氨酸。[结论]该研究为黑木耳的育种和实际生产提供参考。

黑木耳；锁状联合；培养基

黑木耳(Aurieuzariaauricular)真菌学分类属担子菌纲木耳目木耳科，其营养价值与动物性食物相当，同时具有益气补血、促进免疫功能和抗癌等作用，兼具食用和药用价值[1]。研究表明，锁状联合是黑木耳菌丝生长发育过程中明显的指示特征，其对黑木耳的产量和生产周期有重要的作用[2]。关于环境因素及不同培养基成分对黑木耳菌丝生长的影响已有报道，但是不同培养基对黑木耳锁状联合菌丝比率影响的研究还鲜有报道。鉴于此，笔者以黑木耳品种H29为试验材料，研究不同浓度的葡萄糖、蛋白胨及丙氨酸对其锁状联合菌丝比率的影响，以期为黑木耳的育种和实际生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株。供试菌株“黑微29”(H29)购于黑龙江省科学院微生物研究所。

1.1.2 培养基。PDA固体培养基[3]：马铃薯 200.0 g、葡萄糖 20.0 g、蛋白胨 5.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO41.5 g、VB110.0 mg、琼脂 20.0 g、水 1 000 mL、pH 5.5。基础培养基：KH2PO43.0 g、MgSO41.5 g、VB110.0 mg、琼脂 20.0 g、水 1 000 mL、pH 5.5。碳源培养基：在基础培养基中添加不同浓度的葡萄糖(无氮培养基)。氮源培养基：在基础培养基中添加不同浓度的蛋白胨(无碳培养基)[4]。氨基酸培养基：在基础培养基中添加不同浓度的丙氨酸(Ala)[5]。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化与培养。用接种铲将供试菌株转接到PDA平板培养基上，置于25 ℃恒温培养7 d。

1.2.2 单因素试验。向基础培养基中分别加入不同浓度的葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸，使葡萄糖终浓度分别为0、10.0、20.0、30.0、40.0 mg/mL；蛋白胨终浓度分别为0、2.5、5.0、7.5、10.0 mg/mL；丙氨酸终浓度分别为0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL。将活化的菌种用打孔器取出5 mm的菌种块，接种到含有不同浓度葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸的平板培养基中央(插片)[6-7]，各因素各水平设6个重复试验。以添加马铃薯的基础培养基为对照。

1.2.3 正交试验。根据单因素试验结果，每个因素选取最优的浓度水平，采用L9(34)正交试验因素水平表对黑木耳锁状联合所需葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸的浓度进行优化试验，每个组合设置6个重复(表1)。

表1 正交试验因素和水平设计

1.3 测定方法 培养12 d后，随机选取每组5个平板培养基，取出插片用于显微镜下观察计数，记录锁状联合个数、菌丝数。锁状联合菌丝比率=锁状联合个数/菌丝数，加葡萄糖(蛋白胨、丙氨酸)的培养基锁状联合菌丝比率=加葡萄糖(蛋白胨、丙氨酸)的培养基锁状联合菌丝比率-对照培养基锁状联合菌丝比率。

1.4 数据分析 所有试验数据均采用Excel和SPSS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果 由表2可知，在不同浓度的葡萄糖培养基中，随着葡萄糖浓度的增加，H29的锁状联合菌丝比率呈现先增后减趋势，说明添加一定浓度的葡萄糖对锁状联合菌丝比率有促进作用。当葡萄糖的浓度为20 mg/mL时，锁状联合菌丝比率最高；在不同浓度的蛋白胨培养基中，蛋白胨浓度的增加对H29的锁状联合菌丝比率有一定的促进作用。当蛋白胨的浓度为5.0 mg/mL时，锁状联合菌丝比率最高，低于或高于此浓度时，促进作用呈现下降趋势，因此有利于H29锁状联合菌丝比率提高的最佳蛋白胨浓度为5.0 mg/mL。在不同浓度的丙氨酸培养基中，随着丙氨酸浓度的增加，H29的锁状联合菌丝比率呈现先上升后降低趋势。当培养基中丙氨酸的浓度为3 mg/mL时，锁状联合菌丝比率为0.924±0.230，达到最高值，说明该浓度的丙氨酸对H29锁状联合菌丝比率具有明显的促进作用。因此，可将该浓度选为该因子影响锁状联合菌丝比率的最佳浓度。

表2 不同浓度的葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸对黑木耳锁状联合菌丝比率的影响

Table 2 Effects of glucose，peptone and alanine concentrations on the clamp-connection hyphae ratio ofAuriculariaauricular

种类Type浓度Concentrationmg/mL锁状联合菌丝比率Clamp⁃connectionhyphaeratio葡萄糖Glucose00．357±0．05010．00．517±0．02420．00．963±0．14730．00．589±0．06440．00．395±0．036蛋白胨Peptone00．260±0．0262．50．398±0．0365．01．004±0．1497．50．558±0．03910．00．376±0．03400．283±0．0691．00．434±0．045丙氨酸Alanine2．00．574±0．0453．00．924±0．2304．00．661±0．066

2.2 正交试验 由表3可知，影响“H29”锁状联合菌丝比率的因素主次依次为A、B、C，即主要的影响因子为葡萄糖，次要的为蛋白胨，而丙氨酸的影响最小。方差分析表明，A和B 2个因素在α=0.05水平上对“H29”锁状联合菌丝比率的影响存在显著差异。因此，提高“H29”锁状联合菌丝比率的最佳方案是A2B3C3，即葡萄糖20 mg/mL、蛋白胨6 mg/mL、丙氨酸3.5 mg/mL。

3 结论与讨论

黑木耳菌丝体生长发育过程中对养分的需求是以含碳的物质(如葡萄糖、蔗糖、淀粉等)、木质素和含氮的物质(如氨基酸、蛋白胨、蛋白质等)为主。此外还需要少量的无机盐(如钙、磷、铁、钾、镁等)[8-10]。有关于碳源、氮源、氨基酸等对黑木耳菌丝的生长发育的影响已有报道，但对于培养基的不同成分及不同浓度对黑木耳锁状联合的影响目前还鲜有报道。该试验选取的碳源为葡萄糖，氮源为蛋白胨、氨基酸为丙氨酸。葡萄糖为单糖，有研究表明相比于双糖和多糖，黑木耳菌丝对单糖的吸收和利用较高；氮源为蛋白胨，蛋白胨属复合氮源，培养基经过高压灭菌后蛋白胨会分解成多种营养物质，更有利于黑木耳菌丝的吸收利用[11]；氨基酸为丙氨酸，低浓度的丙氨酸有利于黑木耳菌丝的生长且可促进其形成耳基。该试验结果表明适当浓度的葡萄糖、蛋白胨对黑木耳锁状联合菌丝比率的影响较显著，蛋白胨比葡萄糖的作用效果更为显著，且用量也比葡萄糖少。由此可知，在培养基中添加适当浓度的葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸对黑木耳锁状联合菌丝比率有明显的促进作用，在黑木耳生产中可以考虑适当添加，以缩短黑木耳菌丝的培育周期。在黑木耳2、3级菌种的生产中是否需要添加适当浓度的葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸需要进一步研究。该试验在提高黑木耳生产效率、增加栽培者经济收入上都具有重要的研究价值。

表3 葡萄糖、蛋白胨、丙氨酸浓度正交试验结果

Table 3 Concentration of glucose，peptone and alanine of orthogonal test

组合数Combinationnumber因素Factor∥mg/mL葡萄糖(A)Glucose蛋白胨(B)Peptone丙氨酸(C)Alanine与对照试验锁状联合菌丝比率之差Differenceofclamp⁃connectionhyphaeratiocomparedwiththecontrol115．04．02．50．040215．05．03．00．869315．06．03．51．063420．04．03．01．131520．05．03．51．222620．06．02．51．813725．04．03．51．113825．05．02．50．535925．06．03．00．813K10．6570．7610．796K21．3890．8750．938K30．8201．2301．133R0．7320．4690．337

[1] 邹莉，姜童童，王玥，等.LED光源不同光质对黑木耳菌丝体生长的影响[J].安徽农业科学，2014，42(10)：2855-2856.

[2] 顾龙云.浅谈锁状联合[J].食用菌，1982(2)：43.

[3] 刘涛，刁治民，祁永青.碳源和氮源对杏鲍菇菌丝生长的影响[J].北方园艺，2009(6)：222-224.

[4] 张玉龙，石文平，王承禄，等.不同培养基对黑木耳菌丝生长的影响[J].辽宁林业科技，2009(5)：46-47.

[5] 孟庆英.黑木耳最佳母种培养基的筛选研究[J].黑龙江农业科学，2010(12)：5-6.

[6] 赵萍.氨基酸对黑木耳菌丝生长发育的影响[J].甘肃农业大学学报，1997(2)：159-162.

[7] 杜春梅，欧滢蔓，董锡文，等.三种维生素对滑菇固体培养的影响[J].北方园艺，2014(21)：149-151.

[8] 蔡信之.插片法观察放线菌霉菌效果好[J].实验教学与仪器，1995(2)：28.

[9] 肖玫，赵桂龙，李俊峰.黑木耳的生物特性及栽培管理及应用价值[J].农业工程技术·农业产业化，2004(5)：56-57.

[10] 林衍铨，马璐，应正河，等.碳源和氮源对绣球菌菌丝生长的影响[J].食用菌学报，2011，18(3)：22-26.

[11] 班立桐，王文治，周宗寰.碳源和氮源对网脉木耳菌丝生长影响的研究[J].天津农林科技，2006(2)：10-11.

Effects of Culture Medium on Clamp-connection Hyphae Ratio ofAurieuzariaauricular

WANG Yan1, DU Chun-mei1,2, JIANG Zhong-yuan3, DONG Xi-wen1,2*

(1. College of Life Sciences, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007; 2. Institute of Microorganisms, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007; 3. Office of Academic Affairs, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007)

[Objective] To study the effects of glucose, peptone and alanine in culture medium on clamp-connection hyphae ratio ofAurieuzariaauricular. [Method] WithA.auricularH29 as the test materials, plate culture method was adopted. The optimal concentrations of glucose, peptone and alanine that promoting the clamp-connection hyphae ratio were determined by single factor test. The optimal constitution was determined by orthogonal test. [Result] The appropriate concentrations of glucose, peptone and alanine could improve the clamp-connection hyphae ratio ofA.auricularH29. The optimal concentration combination was 20 mg/mL glucose, 6 mg/mL peptone and 3.5 mg/mL alanine. [Conclusion] This research provides references for the breeding and practical production ofA.auricular.

Aurieuzariaauricular; Clamp connection; Culture medium

佳木斯大学校长创新创业基金研发项目(xzyf2014-17)；佳木斯大学研究生科技创新项目(LZZ2015-007)。

王妍(1990- )，女，黑龙江鹤岗人，硕士研究生，研究方向：黑木耳栽培及育种。*通讯作者，教授，博士，从事微生物学研究。

2016-11-09

S 646.6

A

0517-6611(2016)35-0049-02