疟疾的实时荧光PCR快速检测方法探讨

张国斌

（沈阳市疾病预防控制中心，辽宁 沈阳 110031）

疟疾的实时荧光PCR快速检测方法探讨

张国斌

（沈阳市疾病预防控制中心，辽宁 沈阳 110031）

目的 探讨疟疾的实时荧光PCR快速检测方法。方法 选择本市国际旅行卫生保健中心提供的疟疾镜检阳性血样20份，另选择健康者（疟疾镜检阴性）血样20份作为待测血样。本研究设计了疟疾病原体实时荧光PCR快速检测的引物和探针，总结了快速检测方法，疟疾镜检阳性/阴性血样均各分为4次检测完毕，统计各份血样检测结果和每次检测时间，计算平均用时和疟疾镜检与实时荧光PCR检测符合率。结果 疟疾镜检阳性血样20份，检测4次，平均用时（19.15±1.34）min，疟疾镜检阴性血样平均用时为（19.52±1.49）min，40份血样荧光PCR检测平均用时（19.34±1.65）min。在荧光PCR检测与疟疾镜检符合率方面，阳性血样（100%）和阴性血样（90.00%）比较，无显著差异P＞0.05，认为无统计学意义。40份待测血样荧光PCR检测和疟疾镜检符合率为95.00%（38/40）。结论 本研究疟疾病原体实时荧光PCR快速检测准确性高，阳性检出高，检测时间段，用于疟疾快速检验可行性较强，不易发生漏检情况。

疟疾；实时荧光；PCR；快速检测；巢式PCR

疟疾是我国流行病防治的重点，检测诊断多依靠疟原虫形态检查、抗体血清学检查以及疟原虫体抗原检测等方法，镜检是较为可靠的疟原虫检测方法，但存在各种限制因素，假阴性率较高，较容易出现漏诊情况，故需要探索一套更为灵敏、快捷的检测方法[1]。为此，为此，本研究设计了疟疾病原体实时荧光 PCR快速检测的引物和探针，总结了一套快速检测方法，选择本市国际旅行卫生保健中心提供的疟疾镜检阳性血样20份，另选择健康者（疟疾镜检阴性）血样20份作为待测血样，统计各份血样检测结果，对比分析了疟疾镜检与实时荧光 PCR 检测符合率，报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料：选择本市国际旅行卫生保健中心提供的疟疾镜检阳性血样20份，另选择健康者（疟疾镜检阴性）血样20份作为待测血样。40份血样均为静脉血，采用真空采血管（2%EDTA-Na2抗疑）采血，在本实验室按要求（20 ℃）保存。

1.2 试剂及DNA提取：本单位采用Qiagen公司全血DNA提取试剂盒和荧光PCR试剂。按QIAamp DNA Blood Extraction Minikit提取疟原虫DNA并低温保存。

1.3 引物设计合成：恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的SSU rRNA基因的引物和探针，由上海生工生物工程公司合成，包括实时荧光PCR检测的引物、探针。各引物扩增参数为：Plas-FP 、Plas-RP和Plas-Pro扩增长度73 bp；rPLUout-FP和rPLUout-RP扩增长度1815 bp；rPLUin-FP和rPLUin-RP扩增长度240 bp。使用TaqMan体系配置行荧光PCR检测，58 ℃收集荧光，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，随后进行扩增产物电泳分析，凝胶成像系统结果拍照并分析。

1.4 研究方法：疟疾镜检阳性血样20份，每次检测5份，共分为4次检测完毕，统计各份血样检测结果和每次检测时间，计算平均用时。疟疾镜检阴性血样处理方法同上。统计疟疾镜检与实时荧光PCR检测符合率。

1.5 统计学方法：采用SPSS20.0统计学软件分析研究数据，计量资料采用t检验；计数资料采用χ2检验，P＜0.05认为差异显著，有统计学意义。

2 结 果

2.1 疟疾实时荧光PCR检测时间：疟疾镜检阳性血样20份，检测4次，用时为18～20 min，平均 （19.15±1.34）min。疟疾镜检阴性血样20份，检测4次，用时为18～21 min，平均 （19.52±1.49）min。疟疾镜检阴性血样和疟疾镜检阳性血样荧光 PCR检测时间无明显差异P＞0.05，40份血样荧光PCR检测平均用时（19.34±1.65）min，约为20 min。

2.2 疟疾实时荧光PCR检测结果与镜检比较：疟疾镜检阳性血样20份中，荧光PCR检测阳性20份，荧光PCR检测和疟疾镜检符合率为100%（20/20）。疟疾镜检阴性血样20份中，荧光PCR检测阴性为18份，检出阳性2份，荧光PCR检测和疟疾镜检符合率为90.00%（18/20）。在荧光PCR检测与疟疾镜检符合率方面，阳性血样（100%）和阴性血样（90.00%）比较，无显著差异P＞0.05，认为无统计学意义。40份待测血样荧光PCR检测和疟疾镜检符合率为95.00%（38/40）。

3 讨 论

我国并非疟疾疫区国家，但是近年来我国劳动力输出增多，较多疟疾疫区生活人员往来于我国境内，因而必须有效控制疟疾的传入。国境口岸等单位是负责疟疾检测工作的主要部门，需要应对各类疟疾检测，但传统疟原虫形态检查、抗体血清学检查以及疟原虫体抗原检测等方法，存在耗时长或一次检测数量有限等问题，影响了疟疾病原体检测效率。为此，应更为快捷、准确的疟疾检测系统[2]。

近年来，基因扩增技术趋于成熟，因而应探索该方法在疟原虫基因检测方面的优势性。为此，本次研究基于各类疟疾病原体的SSU rRNA基因序列，设计了荧光PCR快速检测的引物和探针，形成了一套通用型实时荧光PCR快速检测方法。实时荧光PCR快速检测时间较短，本次研究40份血样荧光PCR检测平均用时（19.34±1.65）min，约为20 min，可知其检测速度较快，检测效率明显提升。当前，国内对实时荧光PCR快速检测逐渐增多，但是对于快速检测的准确性仍存在一定的争议，尚无可靠论据[3]。本次研究对比分析了疟疾镜检阳性血样与阴性血样的荧光PCR快速检测结果，发现镜检阳性血样荧光PCR检测和疟疾镜检符合率达到了100%（20/20），而疟疾镜检阴性血样20份中，荧光PCR检测阴性为18份，荧光PCR检测和疟疾镜检符合率为90.00%，疟疾镜检阳性血样与阴性血样的荧光PCR快速检测结果无显著差异，40份待测血样荧光PCR检测和疟疾镜检符合率高达95.00%（38/40），可知荧光PCR快速检测结果较为准确、可靠，提示该快速检测方法实验室应用价值较高。但是本次研究在对比阴/阳血样荧光PCR快速检测结果中也发现，虽然镜检阳性血样荧光PCR检测和疟疾镜检符合率较高，但是疟疾镜检阴性血样20份中，检出阳性2份，存在一定的假阳性概率，而无假阴性血样，提示在荧光PCR快速检测中应对阳性病例，再次实施疟疾镜检，以排除假阳性病例，保证检测结果准确性。当前，荧光PCR快速检测技术快速发展，多数通用荧光PCR快速检测设备已经可以完成1次90份以上的检测量，基本可以满足国境口岸等单位大规模检测的需求，对于我国疟疾防控工作具有重要意义。

综上所述，本研究疟疾病原体实时荧光PCR快速检测准确性高，阳性检出高，检测时间段，用于疟疾快速检验可行性较强，不易发生漏检情况。

[1] 营雅茹,李卫东,张滔,等.快速检测试剂条、镜检和PCR在疟疾诊断中的应用研究[J].中华疾病控制杂志,2014,10(2):163-165.

[2] 祁军,于智睿,黄吉城,等.交叉引物等温扩增技术在恶性疟疾快速检测中的应用[J].中国媒介生物学及控制杂志,2013,8(3):204-207.

[3] 孙亚维,鲁峰,张劼楠.疟疾Dia Med Opti MAL-IT快速检测技术的临床应用[J].中国卫生检验杂志,2012,5(7):1604-1605.

R531.3

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1671-8194（2017）07-0017-02