MPTP诱导小鼠帕金森病亚急性模型和慢性模型的比较

樊开阳 朱丽娜 张文利 张海瑞 张 瑜 马 莉

(大连医科大学流行病学教研室,辽宁 大连 116044)

MPTP诱导小鼠帕金森病亚急性模型和慢性模型的比较

樊开阳 朱丽娜 张文利1张海瑞2张 瑜 马 莉

(大连医科大学流行病学教研室,辽宁 大连 116044)

目的 探讨对比1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病(PD)小鼠亚急性模型和慢性模型的行为学及组织病理学变化。方法 亚急性模型C57/BL小鼠腹腔注射MPTP 25 mg/kg，每天1次，连续注射7 d；慢性模型C57/BL小鼠腹腔注射MPTP 25 mg/kg，每周注射2次，连续注射5 w。通过爬杆实验和悬挂实验检测小鼠的行为学变化；应用高效液相色谱法检测纹状体内多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)的含量；应用免疫组化染色法检测中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果 与对照组相比，慢性组小鼠行为学改变明显，而亚急性组小鼠无明显改变。在爬杆实验中，慢性组小鼠爬杆所用的时间长于亚急性组；悬挂实验中，慢性组小鼠悬挂时间低于亚急性组。两组小鼠纹状体DA含量明显降低(P<0.05)，但慢性组与亚急性组相比DA含量降低程度更明显(P<0.05)；而5-HT含量未见明显改变(P>0.05)；中脑黑质致密部TH阳性细胞减少方面，亚急性组下降至对照组28%，慢性组下降至对照组的17%；慢性组HE染色切片中的神经细胞凋亡最多，而亚急性组神经细胞相对凋亡较少。结论 MPTP的PD小鼠慢性模型与亚急性模型相比，具有更明显的与人类PD相似的临床症状，是以后进一步研究PD病理生理学机制的潜在稳定模型。

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)；帕金森病

帕金森病(PD)是一种常见于中老年的神经退行性进展性疾病，主要表现为震颤、肌强直、运动迟缓和姿势步态异常，主要病理改变为黑质纹状体多巴胺(DA)能神经元的选择性缺失以及胞质内涵物Lewy小体的形成。为了更深入地研究PD的病因学、病理、代谢生化及治疗等，制作最接近PD病人临床症状的长期PD动物模型至关重要。PD在动物中没有自发的倾向，进行PD病理机制研究必须建立适当的动物模型。目前人们已创造和建立了多种PD动物模型，主要是神经毒剂损伤模型和转基因模型，前者包括1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)灵长类及小鼠模型，6-羟基DA大鼠模型以及利血平、鱼藤酮、百草枯等模型；后者主要是小鼠及果蝇转基因模型等〔1〕。其中MPTP致PD小鼠模型由于作用明确，是目前最常用的PD动物模型之一〔2〕，它能较全面地反映PD病因及发病机制、病理特点。MPTP小鼠模型应用较多的是急性或亚急性PD模型，但该模型损伤易在较短时间内恢复。而人类PD是一个长期的进行性发展性疾病，需要一个能产生损伤保持时间长从而达到接近临床PD病理变化的稳定模型。而研究表明MPTP诱导的小鼠慢性PD动物模型就具备这一优势〔3〕。本次研究通过比较亚急性和慢性PD模型，动物的行为学和组织病理学变化的不同，验证慢性模型在探讨PD发病机制方面的可靠性。

1 材料与方法

1.1 材料 MPTP，DA，5-羟色胺(5-HT)均购于Sigma公司；小鼠抗酪氨酸羟化酶(TH)单克隆抗体：购于Abcam公司；SP法免疫组化试剂盒：购于北京中杉金桥生物技术有限公司。其余试剂为国产分析纯。高效液相色谱仪,美国Waters，型号 1525；倒置荧光显微镜，日本Olympus，型号CKX41。SPF级雄性C57/BL小鼠，8～10周龄，体重20～25 g，购自大连医科大学SPF级实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型制作 C57/BL雄性小鼠30只，按随机数字表分为亚急性组、对照组、慢性组，每组10只。MPTP用生理盐水溶解，配制成2.5 mg/ml溶液，小鼠腹腔注射，具体方法见表1。

表1 MPTP致小鼠模型建立

组别药物给药量给药时间间隔给药次数对照组生理盐水10ml/kg3.5d/次10亚急性组MPTP25mg/kg(10ml/kg)1d/次6慢性组MPTP25mg/kg(10ml/kg)3.5d/次10

1.2.2 行为学检测 每次注射完之后，观察小鼠活动情况有无异常。最后一次注射后1、3 d分别进行行为学测试(爬杆和悬挂)，在每次正式实验之前，每只小鼠需进行一次预实验。

1.2.2.1 爬杆测试 制作一个直径1 cm，长50 cm并且顶端固定有一个直径为1.5 cm小球的杆，并且缠上纱布以增加摩擦，将杆竖直放置。将小鼠头放置在小球上，记录小鼠从开始运动到完全转为头向下的时间和爬杆底部的时间。每只小鼠进行3次实验，记录数据，取均值。

1.2.2.2 悬挂测试 将小鼠前爪悬挂于距地面30 cm水平放置的金属丝上，记录从开始悬挂至落地时的时间；

1.2.3 取材 最后一次注射后第7天，动物处死解剖取组织：(1)每组随机抽取4只小鼠，麻醉后用4%多聚甲醛灌注固定，取整个脑组织并放入4%多聚甲醛中4℃保存；(2)每组剩余的6只小鼠摘除眼球取血后处死，解剖，取纹状体并用锡箔纸包好后-80℃保存。

1.2.4 免疫组织化学检测 取出浸泡在4%多聚甲醛中4℃保存的脑组织，石蜡包埋，中脑黑质部冠状切片，制作石蜡切片，然后进行苏木素-伊红(HE)染色及TH免疫组织化学染色。

1.2.5 高效液相色谱法(HPLC)检测 色谱柱：C18柱(3.9 mm×150 mm)；流动相：V(甲醇)∶V(0.03%三氟乙酸)=3∶97，pH3.7；流速1 ml/min；荧光检测：激发波长280 nm，发射波长315 nm；柱温35℃，进样量：20 μl；流动相的配制：色谱纯甲醇为A液，取300 μl纯的三氟乙酸用超纯水定容到1 000 ml得0.03%三氟乙酸溶液(B液)，A∶B=3∶97。配制DA和5-HT的标准品溶液，浓度分别是200 ng/ml和160 ng/ml。取出-80℃保存的小鼠纹状体并进行蛋白提取。

1.3 图像和统计学处理 用SPSS17.0软件行因素方差分析；免疫组化图片运用IPP软件进行分析处理。

2 结 果

2.1 各组小鼠行为学变化 慢性组小鼠在第4次给药后，每次注射完毕3 min内出现肢体僵直、竖尾、竖毛、呼吸急促，随后出现平衡障碍，身体剧烈震颤，暴躁等现象，20 min后恢复，但活动减少，对外界刺激反应低下，12 h后恢复正常状态。亚急性组和对照组无明显异常变化。

2.1.1 爬杆 与对照组相比，亚急性组小鼠的爬杆时间无统计学差异(P>0.05)，而慢性组小鼠的爬杆时间差异显著(P<0.05)，慢性组小鼠爬杆时间明显大于亚急性组(P<0.05)。见表2。

2.1.2 悬挂 与对照组相比，亚急性组小鼠的悬挂时间无统计学差异(P>0.05)，而慢性组小鼠的悬挂时间差异显著(P<0.05)，且慢性组小鼠悬挂时间明显低于亚急性组(P<0.05)。见表2。

2.2 纹状体中DA和5-HT的含量 与对照组相比，慢性组和亚急性组小鼠纹状体中DA的含量明显降低(P<0.05)；而慢性组与亚急性组相比，DA含量明显降低(P<0.05)；三组小鼠纹状体中的5-HT含量有一定变化，但无统计学差异(P>0.05)。见表3。

组别爬杆时间1d3d悬挂时间1d3d对照组8.31±2.588.06±3.6186.38±39.4091.77±62.44亚急性组8.11±2.459.26±2.7299.00±50.77102.83±29.16慢性组11.56±3.201)2)14.44±6.011)2)47.69±23.381)2)43.31±18.591)2)

与对照组相比：1)P<0.05；与亚急性组比较：2)P<0.05；下表同

组别DA5-HT对照组1237.16±4.5056.45±46.47亚急性组154.76±28.501)53.82±6.92慢性组37.82±20.261)2)56.04±71.72

2.3 HE染色 见图1。对照组中脑黑质部神经细胞聚集，轮廓清晰，核深染且胞质界限清晰。与对照组相比，亚急性组中脑黑质部切片变化不明显，神经细胞较密集，较少部分的细胞形态改变，核仁染色较浅，部分细胞核消失，胞质较浑浊；而慢性组中脑黑质切片变化较大，部分神经细胞减少，形态改变的细胞较多，核仁染色较浅甚至消失，与胞质的界限不明显。

图1 3组HE染色结果(×400)

2.4 黑质部TH免疫组化染色 三组小鼠的中脑黑质部冠状切片，经TH免疫组化染色发现，与对照相比，慢性组和亚急性组的TH阳性细胞染色显著减弱，亚急性组下降至对照组的28%，慢性组下降至对照组的17%。如图2。

图2 黑质部TH免疫组化染色结果(DAB，×100)

3 讨 论

在本次实验中，慢性组小鼠在实验后期给药后会出现僵直、竖尾、竖毛、呼吸急促，平衡障碍，身体剧烈震颤，暴躁，活动减少，对外界刺激反应低下等现象，虽然持续时间较短，但与PD行为学上的临床表现更为相似。同时，采用爬杆和悬挂实验作为测定小鼠协调运动能力的指标，慢性组比亚急性组小鼠的爬杆所需时间更长，悬挂支撑时间较短，更能表现出PD在行为学上的改变。

PD病理变化核心是黑质致密部DA能神经元的丢失，而MPTP可通过血脑屏障进入脑中，进而生成1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)，MPP+高度亲和DA载体，因此被转运进入DA能神经元，选择性破坏黑质DA能神经元〔4〕，从而产生类似DA的病理改变〔5〕。MPTP对DA能神经元的毒作用主要包括以下几个方面：可以导致一氧化氮(NO)大量生成，导致自由基的过度产生，导致胶质细胞反应性增生，抑制线粒体呼吸链，诱导细胞凋亡〔6〕。这几个方面均可造成黑质致密部DA能神经元的凋亡。而本文主要研究运用MPTP制作亚急性和慢性PD小鼠模型的区别，首先，与对照组相比，亚急性和慢性两种模型都具有一定的可行性。TH是负责催化氨基酸L-酪氨酸转变为二羟基苯丙氨酸(多巴)的酶，而多巴是DA的前提，在DA生物合成中起重要的调节作用。TH阳性神经元数目可反映纹状体DA含量及DA能神经元的数量〔7〕。在本研究中，三组小鼠相互之间的中脑黑质部冠状切片的TH免疫组化染色具有较明显的差异，且慢性组与亚急性组相比减弱程度更明显，从而说明相对于MPTP亚急性模型，MPTP慢性模型更能表现PD病理上的变化。而通过观察小鼠中脑黑质部冠状HE染色切片，发现慢性组的神经细胞凋亡最多，亚急性神经细胞相对凋亡较少，从而说明，在形态学上，慢性模型更符合PD DA神经元凋亡的特征。

5-HT作为神经递质，主要分布于松果体和下丘脑，可能参与痛觉、睡眠和体温等生理功能的调节。在本实验中，三组小鼠纹状体中的5-HT的含量有一定变化，但差异不显著。造成这种情况的原因可能是MPTP高选择性的对DA能造成损伤〔4,8,9〕，但对5-HT神经元可能不具有特异损伤或者特异性损伤较轻。

1 单悌超,任玉娇,于学慧,等.帕金森病模型研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(9):1180-3.

2 刘 静,王彦永,王铭维.帕金森病动物模型的研究进展〔J〕.环境与健康杂志，2008;25(6):561-3.

3 von Bohlen Und，Halbach O.Modeling neurodegenerative diseases in vivo review〔J〕.Neurodegener Dis,2005;2(6):313-20.

4 Ono S,Hirai K,Tokuda E.Effects of pergolide mesilate on metallothionein mRNAs expression in a mouse model for Parkinson disease〔J〕.Biol Pharm Bull,2009;32(10):1813-7.

5 Sakahira H,Breuer P,Hayer-Hartl MK,etal.Molecular chaperones as modulators of polyglutamine protein aggregation and toxicity〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2002;99(4):16412-8.

6 Eriksen JL,Wszolek Z,Petrucelli L.Molecular pathogenesis of Parkinson disease〔J〕.Arch Neurol,2005;62(3):353-7.

7 许 冰,卢昌均.MPTP 诱导影响亚急性与慢性帕金森病模型小鼠黑质多巴胺能神经元〔J〕.华夏医学,2015;28(1):24-7.

8 Li D,Liu Q,Dou D,etal.Protective effect of arctigenin against MPP+ and MPTP-induced neurotoxicity〔J〕.Planta Med,2014;80(1):48-55.

9 Xu D,Duan H,Zhang Z,etal.The novel tetramethylpyrazine bis-nitrone(TN-2)protects against MPTP/MPP+-induced neurotoxicity via inhibition of mitochondrial-dependent apoptosis〔J〕.J Neuroimmune Pharmacol,2014;9(2):245-58.

〔2016-01-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

Comparison of subacute and chronic Parkinson disease model in mice model induced by MPTP

FAN Kai-Yang, ZHU Li-Na, ZHANG Wen-Li,et al.

Department of Epidemiology, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning, China

Objective To compare behavioral and histopathological changes of subacute and chronic Parkinson disease(PD) mice model induced by 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropy ridine(MPTP).Methods Subacute C57/BL mice model was intraperitoneally injected(ip) MPTP 25 mg/kg 1 time per day for 7 days; chronic C57/BL mice model were intraperitoneally injected(ip) MPTP 25 mg/kg 2 times per week for 5 weeks.The behavioral changes of mice was inspected by climbing pole and suspension test; the content of DA in stratium was detected by HPLC; and the tyrosine hydroxylase (TH) expression in substantia nigra was detected by immunohistochemical staining.Results Compared with that of control group，the behavior of chronic model group was changed significantly. The suspension capability of chronic model group was weaker than that of subacute model group in suspension experiment. The content of DA in stratium of chronic and subacute model groups was decreased significantly, and in chronic group, it was significant lower than that of subacute model group (P<0.05). The amount of TH positive cells was reduced in the midbrain substantia nigra compacta. Nerve cell apoptosis was most in chronic group and relatively less in subacute group.Conclusions The chronic PD mice model induced by MPTP has more obvious and similar clinical symptoms and is the potential stability model for further investigating PD pathology physiology mechanism.

1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropy ridine(MPTP); Parkinson′s disease

国家自然科学基金资助项目(81200989)

马 莉(1972-)，女，教授，主要从事慢性病流行病学研究。

樊开阳(1990-)，男，硕士，主要从事帕金森病生物标志物的研究。

R742.5

A

1005-9202(2017)01-0004-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.002

1 大连医科大学生物化学教研室 2 西安医学院卫生管理学教研室