邢台地区血小板志愿捐献者HPA基因资料库的建立

吕冉 刘郁 王朋蕊 高秀俊 王志森

邢台地区血小板志愿捐献者HPA基因资料库的建立

吕冉 刘郁 王朋蕊 高秀俊 王志森

目的 对邢台地区血小板志愿捐献者进行人类血小板抗原（human platelet antigen，HPA）基因分型，建立已知HPA基因型的血小板捐献者资料库。方法采用聚合酶链反应-序列特异性引物（polymerase chain reaction-sequence specific primers，PCR-SSP）方法对随机抽取的150例血小板捐献者进行HPA-1～6和HPA-15抗原系统共14个抗原基因分型。结果邢台地区血小板志愿捐献者HPA的基因频率分别为：HPA-1a 0.953，1b 0.010；2a 0.953，2b 0.086；3a 0.596，3b 0.394；4a 1.000，4b 0；5a 0.967，5b 0.015；6a 0.986，6b 0.010；15a 0.475，15b 0.506。结论邢台地区血小板志愿捐献者HPA-1～6和HPA-15抗原系统的基因频率符合Hardy-weinberg遗传定律，与其他地区和国家的同类资料相比显示出种族和地域性差异，应建立邢台地区已知HPA基因型的血小板捐献者资料库。

邢台地区 HPA基因型 血小板血型

血型是人类血液细胞的主要特征之一，也是人类的一种遗传标记，具有种族差异，血小板血型也是如此。研究证明血小板表面具有复杂的血型抗原，这些抗原由遗传决定，通常分两类，一类是与其他细胞表面或组织共同的抗原，称血小板相关抗原；另一类为血小板特异性抗原。相关抗原主要与红细胞的ABO血型系统以及人类白细胞抗原（HLA）有关；特异性抗原由血小板特有的抗原决定簇组成，表现为血小板独特的遗传多态性，在其他细胞和组织上不能发现[1]。

血小板输注用于预防和治疗血小板减少或血小板功能缺失引起的出血，是临床上重要的支持方法；然而临床上盲目反复输注血小板患者的血清中可产生血小板同种抗体，当再输入血小板后，会迅速产生血小板抗原和抗体的免疫反应，患者出现畏寒、发热等症状。输入的血小板会迅速破坏，血小板计数不仅不升高，有时反而会下降，陷入血小板输注无效状态，输注血小板后产生抗体的频率主要取决于输注次数，次数越多，抗体产生的频率越高[2]。同时在临床血小板输注过程中，如果血小板抗原不相匹配，可导致受血者机体产生同种抗体，抗原不配合的比例越高，产生抗体的机会就越多，引起患者出现血小板输注无效的概率越大。所以在输注血小板时，除积极对患者进行血小板抗体筛选外，建立HPA基因型血小板捐献者资料库对临床医学和输血实践具有十分重要的意义。

血清学方法是目前实验室普遍应用的HPA分型方法，但难以获得高质量的抗血清且价格昂贵，同时患者难以提供大量的血小板用以血清学分型，使得该方法难以开展。随着分子生物学技术的发展，许多方法开始应用于HPA 的基因分型，目前国外已报道的HPA基因分型方法有限制性片段长度多态性（RFLP）序列特异性寡核苷酸-聚合酶链反应（SSO-PCR）、单链构象多态性（SSCP）序列特异性引物-聚合酶链反应（PCR -SSP）等，其中以PCR-SSP应用最广泛。本研究采用PCR-SSP法对邢台地区150例随机献血者进行HPA-1～6和HPA-15抗原14个等位基因的检测分析，并进行统计分析，以根据分布频率来预测血小板同种免疫发生的可能性，确定有临床意义的血小板抗原系统，以寻找更合适的血小板输注，保证输血安全性和有效性。

材料与方法

1 标本来源 150份标本来源于邢台市汉族人群中健康无血缘关系的无偿献血者。

2 主要仪器和试剂 PCR扩增仪（eppendorf）、电泳仪（北京市六一仪器厂DYY-6C型）、JS-860B凝胶成像分析仪（上海培清科技有限公司）；Taq酶（美国Promaga公司）、血小板基因DNA提取试剂盒（北京康为公司，批号00071408）、血小板抗原基因分型试剂盒（天津市秀鹏生物技术开发有限公司 201409011）

3 DNA提取 采集EDTA抗凝静脉血3～5 ml，按照血小板基因DNA提取试剂盒说明书操作，提取DNA，并储存–20℃备用。

4 PCR-SSP扩增 严格按照血小板抗原基因分型试剂盒说明书对HPA-1～6和HPA-15共14个抗原进行基因分型。HPA引物浓度为：HPA-1、2、4、6浓度0.2 μmol/L，HPA-3、5、15浓度1 μmol/L。配制dNTP-Buffer工作液：440 μl浓缩dNTP-Buffer加入560 μl无菌水配制成1 000 μl dNTP-Buffer工作液。配制Buffer-酶-标本混合液（每人份用量）：取320 μl dNTP-Buffer工作液、3.3 μl Taq酶、50 μl DNA标本混合，总反应体积373.3 μl混合液。漩涡混匀Buffer-酶-标本混合液，并瞬间离心，使液体置于管底，分别向PCR反应板每个引物孔各加入10 μl上述混合液，每孔再分别加入15～20 μl石蜡油，用密封膜封好。将反应板放入设置好循环参数的PCR扩增仪内，扩增程序：96℃/3 min，1个循环；，96℃/25 s，68℃/45s，72℃/30 s，5个循环；96℃/25 s，61℃/45 s，72℃/30 s，22个循环；96℃/20 s，55℃/45 s，72℃/60 s，8个循环；72℃/3 min，1个循环；4℃保存。

5 琼脂糖凝胶电泳 将每个PCR产物5～10 μl转移到2.5%琼脂糖凝胶孔中，在140～150 V电压电泳15～20 min，在凝胶成像系统下观察并记录。

6 统计学处理 基因频率采用基因计数法，并进行基因分布的Hardy-weinberg平衡验证；不同人群间基因频率分布的比较采用 χ2检验。

结 果

1 HPA-1～6，15基因分布 本地区人群HPA-1～6，15系统基因分型频率符合Hardy-weinberg平衡定律；HPA-15和HPA-3是具有高杂合度的血型系统，尤其是HPA-15杂合度最高。HPA-3，15系统抗原频率相近；HPA-1、2、4、5、6系统以aa基因型为主，HPA-1检出4例a/b杂合子；HPA-2检出20例a/b杂合子，检出1例b/b纯合子；HPA-5检出5例a/b杂合子；HPA-6检出4例a/b杂合子；HPA-1，4，5，6均未检出b/b纯合子（表1）。

2 不同人群HPA-1～6，15基因分布比较 HPA-3与我国其他地区同类资料比较χ2=4.82，差异无统计学意义（P＞0.05）；与印尼、英国、刚果等相比χ2=5.64，差异无统计学意义（P＞0.05）；HPA-5和HPA-15和刚果、喀麦隆比较χ2=20.50、χ2=31.20，P＜0.05，差异有统计学意义（表2）。

表1 150例献血者HPA的基因型和基因频率

表2 不同人群HPA等位基因频率的比较

讨 论

人类血小板表面存在众多复杂的血型抗原，主要有白细胞抗原、红细胞抗原和HPA。HPA为血小板自身特异性抗原，位于血小板膜糖蛋白上，由多个基因座位决定，每个基因座位上存在共显性遗传的双等位基因，具有高度多态性。在现今的血液输注治疗中，血小板成分输注会产生输注后紫癜、输注无效等同种免疫反应的发生，占全部输血反应的10.04%，其中约20%的反应因HPA抗体产生。由于HPA抗体引起的输血反应程度远高于HLA抗体[11]，这是因为血小板抗原不合的输注可导致机体产生同种抗体，引起病理性同种免疫反应而致血小板破坏，此类患者输注HPA同型的单采血小板则显得尤为重要。在已命名的23个HPA抗原中，有12个抗原组成了6个抗原系统，包括HPA-1～5、15。其中HPA-3和HPA-15在中国人群具有广泛的多态性，而HPA-1、2、3、15这4个系统也具有一定的分布，在临床输血与疾病相关性研究中具有重要意义。不同特异性的HPA抗原经输血和妊娠免疫产生血小板特异性抗体，可引起血小板输注无效症及新生儿同种免疫血小板减少症。国内已先后报道抗-HPA-2b，-3a，-4b，-5b，-15a等血小板特异性抗体[12，13]。因此，对患者HPA抗原进行准确快速的分型并从已知血小板供者库中寻找同型供者，对血小板配合性输注十分重要。

本研究发现HPA-1～6和HPA-15基因均有表达，除3a、15a均为高频率表达基因，HPA-b基因中HPA-1、4、5、6没有表达，其余均有表达；除HPA-3b、15b的基因为高频率外，其余均为低频率基因；抗原不配合率的高低反映HPA在输血治疗时，刺激宿主免疫系统产生血小板同种抗体几率的大小。本文结果显示HPA-3、15的不配合率较高，在输血上具有重要的免疫学意义，通过H-W平衡检验证实，随机抽取人群的HPA基因分型结果可以代表本地区人群的分布。目前我们已建立了固定血小板献血者150人份已知HPA基因型的血小板供者库，根据本地区基因分布特点，需对供、受者检测HPA-1～6、15的基因型，今后将每年进行一定数量固定血小板献血者的基因检测，以保障临床治疗的需要。

在临床输血实践中，尽管随机输血导致血小板输注无效涉及的因素甚多，但与抗-HLA和抗-HPA密切相关；前者可以通过滤除白细胞或除去白细胞活性的血小板，以减少抗-HLA的产生；后者需选择HPA相合的血小板输注。预防血小板输注无效的有效途径是调查HPA分布多态性，掌握本地区的优势同种抗原及高危抗原系统，针对特定人群进行血小板抗体筛查，同时建立大样本血小板捐献者资料库进行HPA匹配输注。对中国大部分地区的汉族人群而言，只需检测供者与受（患）者的HPA-2、3、15基因[14]。只要供受者相合，就可以减少血小板输注无效的发生，这样做不但缩短了实验时间，同时也节省了试剂及其耗材，降低了患者的就医成本，更重要的是患者能够及时、有效的输注血小板制剂，提高临床治疗效果，具有重要的免疫学意义和社会效益。

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Establishment of HPA Gene Database for Platelet Donors in Xingtai Area of Hebei

LV Ran，LIU Yu，WANG Pengrui，et al. Xingtai Central Blood Station of Hebei Province，Xingtai，054000

Objective The HPA genotyping of platelet donors in xingtai area was performed，and the HPA genotype of the platelet donors was established.MethodPCR-SSP method was used to randomly select 150 platelet donors who carry out a total of 14 antigens of HPA-1-6 and HPA-15 .ResultThe gene frequencies were found to be 0.953 and 0.010 for HPA-1a and -1b：0.951 and 0.086 for HPA-2a and -2b：0.596 and 0.394 for HPA-3a and -3b：1.000 and 0.000for HPA-4a and -4b：0.967 and 0.015 for HPA-5a and -5b：0.986 and 0.010 for HPA-6a and -6b：0.475 and 0.506 for HPA-15a and -15b.ConclusionThe gene frequencies of HPA-1-6 and HPA-15 antigens in xingtai area of Hebei province coincide with the Hardy-Weinberg genetic law，which shows difference among nationalities and regions.This is the first establishment of HPA genotype database in xingtai.

Xingtai region HPA genotyping Blood platelet

R457.1+<1 R392.11 【文献标识码】 A class="emphasis_bold">1 R392.11 【文献标识码】 A 【文章编号】 1671-2587（2017）01-0055-041 R392.11 【文献标识码】 A

1671-2587（2017）01-0055-04

A 【文章编号】 1671-2587（2017）01-0055-04

2016-08-28）

（本文编辑：王虹）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.01.016

054000 河北省邢台市中心血站（吕冉，刘郁，高秀俊，王志森）；隆尧县医院（王朋蕊）

吕冉（1982–），女，河北邢台人，主管检验师，学士，主要从事免疫血液学工作，（Tel）15033199688，0319-2158864（E-mail）xuelv1980@163.com。