血栓弹力图法和光学比浊法监测PCI术后氯吡格雷疗效的对比研究*

李广华 李阳华 范小斌 谢年谨 李正康 刘长钰 古俊兰

血栓弹力图法和光学比浊法监测PCI术后氯吡格雷疗效的对比研究*

李广华 李阳华 范小斌 谢年谨 李正康 刘长钰 古俊兰

目的 探讨光学比浊法（LTA）和血栓弹力图法（TEG）检测氯吡格雷抵抗（CPGR）的疗效。方法收集2015年1～11月心内科经双联抗血小板治疗并行冠状动脉介入（PCI）后的急性冠状动脉综合征（ACS）患者425例，对ADP诱导的光学比浊法血小板聚集率（LTAADP）与血栓弹力图法ADP诱导的血小板抑制率（TEGADP）检测氯吡格雷抵抗（CPGR）进行一致性和相关性分析，结合CYP2C19基因表达的酶活性程度，分析其与LTA和TEG法检测CPGR的关系。结果LTA和TEG法所测血小板聚集率检测CPGR分别为12.0%和11.8%，两者存在负相关（r=-0.351，P＜0.01）；CYP2C19基因酶活性程度与LTA法检测CPGR存在一定的等级相关（r=0.239，P＜0.01），与TEG法检测CPGR的关联无统计学意义（r=-0.088，P=0.70），且在两法检测CPGR上的差异无统计学意义。结论TGE与LTA法在监测氯吡格雷疗效上有很好的一致性，CYP2C19基因酶活性程度与这两种方法检测CPGR的差异无统计学意义。

氯吡格雷抵抗 双联抗血小板 血栓弹力图 光学比浊法CYP2C19基因

氯吡格雷联合阿司匹林抗血小板治疗已成为临床防治急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)或防止经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention，PCI)后再发缺血事件的经典治疗方案[1-2]，国内外研究表明不同患者对氯吡格雷有着不同的反应性[3-6]提示应针对服用氯吡格雷患者制定个体化抗血小板治疗方案，通过及时、准确监测血小板功能，对抗血小板药物疗效进行评价和监控，从而大大提高抗血小板药物的预防与治疗效果。抗血小板药物应用无效甚至抵抗进而达不到预期目的，这一现象称为氯吡格雷抵抗（CPGR）。氯吡格雷通过阻断血小板P2Y12受体发挥抗血小板作用[7，8]。此外也可使血小板膜蛋白乙酰化，抑制血小板膜酶，有助于抑制血小板功能[9]。本文采用TEG与LTA法对425例ACS患者行PCI术后的血小板功能监测，比较不同方法在腺苷二磷酸（ADP）诱导下检测CPGR的相关性，以及CYP2C19基因表达的酶活性程度与这两种方法检测CPGR的差异性。

对象与方法

1 研究对象 选取2015年1～11月广东省人民医院心内科425例行PCI后ACS 患者，男性347例，女性78例，平均年龄（62±1）岁，包括ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死以及不稳定心绞痛。所有患者入院后均同时给予阿司匹林肠溶片（拜阿司匹林，Bayaspirin）100 mg/d和氯吡格雷（波立维，Plavix）75 mg/d口服双联抗血小板治疗，并且至少3 d后12 h内抽取血液测定血小板聚集功能，所有患者血小板计数在正常范围（100×109/L＜ PLT＜350×109/L）。排除：①已知双联抗血小板治疗禁忌证患者；②近期服用过甾体或非甾体抗炎药者；③近3个月内有出血史或脑血管疾病相关事件；④有慢性炎症性疾病者；⑤已知对研究药物或器械过敏者（如氯吡格雷、阿司匹林、普通肝素、造影剂不锈钢等）或过敏体质者；⑥可疑的亚急性细菌性心内膜炎、心包炎和主动脉夹层；⑦有血液疾病、出血倾向者、出血体质，以及有活动性出血者；⑧研究者认为不适合参加本研究。

2 仪器与试剂 CHRONO-LOG MODEL 700血小板聚集分析仪及配套诱导剂二磷酸腺苷（ADP）。美国Haemoseope公司生产的TEG 5000血栓弹力图仪及配套试剂盒，试剂包括ADP（5 ul／L） ，激活剂F（由蝮蛇血凝酶和血小板ⅩⅢa因子混合而成），高岭土（含1%的kaolin液）。上海百傲科技有限公司生产的CYP2C19基因芯片检测试剂盒，采用PCR-基因芯片法检测CYP2C19基因表达的酶活性程度。

3 方法

3.1 光学比浊法（LTA）：使用枸橼酸钠抗凝管空腹采集静脉血2 ml，立即混匀，动作要轻，不可剧烈晃动。经800 r/min 离心10 min和3000 r/ min离心10 min得到富含血小板血浆（PRP）和乏血小板血浆（PPP），在PRP加入诱导剂10μmol/ LADP，用PPP为空白参照，采用LTA法测定，当PRP中透光度改变最大时得到血小板最大聚集率（LTAADP），以百分数表示，4 h内完成检测。

3.2 血栓弹力图测定（TEG）：使用枸橼酸钠和肝素抗凝管空腹采集静脉血2 ml，用3个通道（ADP激活剂，激活剂F，高岭土）检测，MA（maximal amplitude）表示最大血块强度，MAADP值由激活剂ADP激活测定，MA（fibrin）由激活剂F激活测定，MA thrombin通过高岭土和氯化钙激活测定。合成3个通道的测试图得出血小板ADP抑制率（TEGADP ），4 h内完成检测。TEGADP=100-100×[（MAADP-MAfibrin）/（MAthrombin-MAfibrin）]

3.3 氯吡格雷抵抗标准：光学比浊法： 在ADP诱导下血小板最大聚集率≥50%为氯吡格雷抵抗。血栓弹力图法： 在ADP诱导下血小板最大抑制率＜30%为氯吡格雷抵抗[5-7]。

4 统计学处理 应用SPSS19.0软件进行数据分析，一致性分析采用配对卡方检验，两种检测方法采用Pearson相关分析，酶活性程度与两种检测方法采用Spearman秩相关分析，两独立组分层比较采用秩和检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。散点图利用excel软件制作。

结 果

1 两法检测氯吡格雷抵抗的发生率 采用LTA法检出CPGR 51例（12.0%），NCPGR 374例（88.0%）；TEG法检出CPGR 50例（11.8%），NCPGR 375例（88.2%）。见图1、2。

2 LTA与TEG法检测氯吡格雷抵抗(CPGR)的一致性 两法检测CPGR的差异无统计学意义。见表1。

3 两法检测CPGR的相关性分析 对ADP诱导的LTAADP与TEGADP进行Pearson相关分析：r=-0.351，P＜0.01，呈负相关。见图3。

4 CYP2C19基因酶活性程度与两法检测CPGR相关性的比较。

图1 425例患者LTAADP分布散点图

图2 425例患者TEGADP分布散点图

表1 LTA与TEG法检测CPGR的一致性

图3 LTAADP与TEGADP相关性

4.1 CYP2C19基因酶活性程度与LTA法检测CPGR的相关性：Spearman等级相关分析：r=0.239，P＜0.01，呈等级相关。见表3。

4.2 CYP2C19基因酶活性程度与TEG法检测CPGR相关性 Spearman等级相关分析：r=-0.088，P＞0.05，可认为酶活性程度与TEGADP的相关性无统计学意义。见表4。

表3 CYP2C19基因酶活性程度与LTA法检测CPGR的相关性

表4 CYP2C19基因酶活性程度与TEG法检测CPGR的差异性

5 CYP2C19基因酶活性程度在LTA法和TEG法检测CPGR上的差异性 采用秩和检验，Z=-0.984，P＞0.05，可认为LTA和TEG法检测CPGR在CYP2C19基因酶活性程度表达上的差异无统计学意义。见表5。

表5 CYP2C19基因酶活性程度在两法检测CPGR上的相关性

讨 论

氯吡格雷是一种新型的噻吩吡啶类抗血小板药物，在体内经CYP2C19代谢后产生活性产物，起到抗血小板作用。人体CYP2C19基因型决定CYP2C19酶代谢能力。氯吡格雷联合阿司匹林双重抗血小板治疗是目前ACS及PCI经典的治疗方案，能明显降低心血管事件及术后再狭窄的发生率。但抗血小板药物的应用存在无效甚至抵抗或用药过量的问题，有分析认为氯吡格雷存在无效甚至抵抗的可能原因是，氯吡格雷作为噻吩并吡啶类药物通过阻断与ADP结合的P2Y12受体，阻断激活血小板聚集反应的途经，抑制血小板聚集功能，但血小板上的ADP受体还有P2Y1，这个受体并未被阻断，血小板聚集率无明显降低，相当一部分患者对氯吡格雷的抗血小板反应性较差，从而在应用氯吡格雷后达不到充分的抗血小板聚集的功效[10]。

LTA法检测血小板聚集功能被认为是血小板功能检测的“金标准”[11-13]，血栓弹力图仪是一种能监测凝血全过程的仪器，TEG法是一种较新颖的检测抗血小板药物疗效的方法。氯吡格雷抵抗的检测方法和判断标准尚不统一。本研究采用口服双联抗血小板药物负荷剂量12 h后的LTAADP与TEGADP 检测值作为CPGR的诊断标准[14-16]，结果显示，LTA与TEG法通过ADP诱导检出CPGR的发生率分别为12%，11.8%，两法检出NCPGR概率分别为88%，88.2%。提示两法对于CPGR检出率大致相同。

CYP2C19作为氯吡格雷氧化代谢的关键酶，其基因的多态性与氯吡格雷抵抗的关系成为近年来的研究热点。本研究所纳入的425例患者均进行了CYP2C19 基因型检测，酶活性程度的高、中、低表示双联抗血小板药物代谢的快、中、慢。因此本实验通过对CYP2C19基因酶活性程度与LTA和TEG法检测CPGR相关性进行统计分析。最终认为LTA和TEG法检测CPGR在CYP2C19基因酶活性程度表达上的差异无统计学意义。

综上所述，LTA与TEG法检测CPGR无明显差异且两个指标存在低度负相关，但两法在检测CPGR对于CYP2C19基因酶活性程度的表达却出现了差异，LTAADP与酶活性程度存在一定的等级相关，TEGADP与酶活性程度不存在等级相关，两者作为独立组等级资料进行秩和检验，差异无统计学意义。究其原因，考虑有以下几个方面：一是部分临床患者存在CPGR现象与个体基因型相关，但不同患者对氯吡格雷反应性并不相同，个体差异大；二是不能排除发生CPGR假阴性的可能性，对于氯吡格雷抵抗的影响因素尚需大样本前瞻性研究来评估；三是通过分析既往患者服用氯吡格雷后总体上CYP2C19基因对个体代谢的影响，发现基因型与酶活性快慢及机体代谢快慢有关，但具体反映到个体身上，除基因多态性外，药物吸收和活性代谢清除的个体差异、饮食、生活习惯、疾病等都有可能影响。有的个体基因影响因素占主导地位，与整体符合率一致，而有的个体其他因素的影响作用更大，盖过了基因的影响作用，所反映出来的是基因表现型决定的酶活性程度与CPGR无明显相关。所以也从另一个方面说明CYP2C19 基因多态性表达的酶活性程度不同与氯吡格雷抵抗尚未有明确关系。

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Comparatively Study on the Thromboelastography and Light Transmission Aggregometry for Platelet Aggregation in Acute Coronary Syndrome Patients after Percutaneous Coronary Intervention under Antiplatelet Therapy

LI Guang-hua，LI Yang-hua，FAN Xiao-bin，et al. Department of Clinical Laboratory，Guangdong General Hospital，Academy of Medical Sciences，Guangzhou，510080

Objective The dual antiplatelet drug for the treatment of percutaneous coronary intervention after operation of acute coronary syndrome patients，the by optical than Light Transmission Aggregometry （LTA） and method of thromboelastography（TEG） detection of clopidogrel resistance（CPGR） consistency analysis，and compare the correlation with the levels of CYP2C19 enzyme activity.MethodsA total of 425 patients with acute coronary syndrome treated with dual antiplatelet therapy and PCI in the Department of Cardiology during the period of January 2015 to November were collected. Consistency and correlation analysis of CPGR induced platelet aggregation rate （LTAADP）and ADP induced platelet inhibition rate （TEGADP） as well as the relationship between the two methods to detect CPGR and CYP2C19 gene expression level were done.ResultsThe platelet aggregation rate measured by the LTA method was used to detect the CPGR as 12%. The platelet inhibition rate measured by the TEG method was used to detect the CPGR as 11.8%. There is a negative correlation between LTAADP and TEGADP （r=-0.351，P＜0.01）; There was a certain degree of correlation between the activity of CYP2C19 gene and the detection of CPGR by LTA method （r=0.239，P=0.00）. No correlation between the degree of activity of CYP2C19 gene and the detection of CPGR by TEG method （r=-0.088，P=0.70）. And no significant difference between the two methods in the detection of CPGR was found.ConclusionTGE method and LTA method to monitor the efficacy of clopidogrel has well consistency，There was no significant difference between the two methods for the detection of CPGR with the degree of CYP2C19 gene activity.

Clopidogrel resistance Dual antiplatelet Thromboelastography Light transmission aggregometry CYP2C19

R541.4 R331.1+43

A

1671-2587（2017）01-0059-05

2016-09-30）

（本文编辑：王虹）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.01.017

*本课题受广东省医学科研基金（No.A2015442）资助

510080 广州，广东省人民医院/广东省医学科学院检验科（李广华，范小斌，李正康，刘长钰，古俊兰）；深圳市光明新区人民医院心血管内科（李阳华）；心内科（谢年谨）

李广华（1974–），男，广东梅州人，副主任技师，硕士，主要从事血栓止血工作，（Tel）13925119975。