赭曲霉毒素A致癌机制研究进展

刘 静，张红英 综述 张祥宏 审校

赭曲霉毒素A致癌机制研究进展

刘 静1，张红英2综述 张祥宏3审校

赭曲霉毒素A；致癌机制；氧化应激

赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)是一种主要由纯绿青霉、碳黑曲霉和赭曲霉产生的真菌毒素，广泛存在于食品、农产品和动物饲料中，因此OTA与人类健康的关系备受关注。研究发现，OTA具有肾毒性、肝毒性、神经毒性、免疫毒性和致畸性[1]。国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer, IARC)1993年把OTA定为“B级人类可能致癌物”[2]。但是，迄今为止有关OTA的致癌作用机制尚不完全清楚。笔者主要就目前备受关注的OTA致癌机制进行综述。

1 OTA致癌性

OTA是啮齿类动物明确的致癌物。美国国家毒物学计划的一项研究，210、70、21 μg/kg体重OTA喂食F344N大鼠。2年后，210 μg/kg体重剂量组出现了肾管状腺瘤和癌，其中72%为雄性，16%为雌性。70 μg/kg体重剂量组，39%的雄性大鼠和4%的雌性大鼠出现了肾腺瘤或癌。OTA诱癌有性别差异，雄性较雌性敏感。此外，还观察到肾脏非新生物形式的病理变化，例如增生、细胞增殖、胞浆改变和核肥大。肾细胞癌转移主要发生在肝、肺和淋巴结[3]。基于此，国际癌症研究中心将OTA界定为B级人类可能致癌物[2]。德意志研究联合会的一个委员会在2003年对工作区域的化学物质的健康危害进行了调查，根据OTA的长期的动物实验研究或流行病学研究的证据认为OTA具有致癌危险，将OTA分为2类致癌物[4]。

除了肾脏肿瘤外，Schwartz[5]提出了OTA暴露可能与睾丸癌发生率增高有关的假说。虽然没有流行病学研究支持此假说，但是实验证明高剂量的OTA引起睾丸癌，并且形成OTA-DNA加合物。乳腺也是OTA的潜在靶目标，OTA增高了乳腺纤维腺瘤的发病率[3]。

2 OTA介导的细胞效应

2.1 OTA诱导氧化应激

2.1.1 机制 ROS诱导的氧化应激及大分子物质损伤被认为是衰老及包括肿瘤在内的慢性疾病的发病机制之一[6, 7]。一些研究结果显示，OTA引发ROS生成，通过各种直接和间接的机制导致氧化应激。

还原系统由磷脂囊泡、NADPH氧化酶、细胞色素P450还原酶和Fe3+组成，OTA可以螯合Fe3+从而减少其还原为Fe2+，在氧存在的情况下，Fe2+提供活性成分开始脂质过氧化[8]。一些学者报道，OTA氢醌/苯醌对由OTA氧化产生，苯醌是半醌和氢醌减少的结果。这些导致氧化还原循环和活性氧的产生。虽然给予OTA处理可以使体外培养的细胞形成苯醌[9]，但是体内环境对于这些反应的生理变化的真正关联还没有得以明确。

遗传毒理学研究为OTA介导的氧化损伤机制的研究提供了又一有力证据。OTA明显降低肾组织中参与氧化应激的基因的表达，其中许多基因的启动子区包含抗氧化调控元件。抗氧化调控元件被Nrf2所识别，Nrf2参与编码解毒、细胞保护、抗氧化酶的基因的基础表达和诱导[10]。这些发现引发了如下假说，即OTA削弱了细胞的抗氧化防御屏障从而使细胞更易于发生氧化损伤，此假说得到了研究人员的证明。

2.1.2 氧化损伤 体内外研究发现OTA可以导致细胞氧化损伤。ROS可以直接引起DNA氧化碱基的形成，形成的DNA氧化碱基又直接导致多种形式的DNA损伤。并且在肿瘤形成中通常可以看到氧化DNA碱基引发的突变。OTA可以诱导体外培养的人胃黏膜上皮细胞GES-1和大鼠肾小管上皮细胞ROS生成增多，形成8-oxoguanine(DNA碱基氧化修饰，氧化损伤标志物)[11, 12]。100 μM OTA处理60min诱导人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和小鼠海马细胞HT22 发生氧化应激[13]。OTA还可以诱导体外培养的人外周血单个核细胞和食管上皮细胞Het-1A发生DNA损伤，出现DNA链断裂[14, 15]。体内实验观察到同样的现象，给予F344大鼠0.25，0.50，1.0和2.0 mg/(kg·d)OTA灌胃2周，彗星实验观察发现肝、肾和脾细胞出现DNA链断裂[16]。Kamp等[17]灌胃F344大鼠0.03, 0.1, 0.3 mg/kg bw/day OTA 4周，所有实验组动物出现肝和肾的氧化损伤。在肝脏和肾脏，DNA的损伤与DNA糖基酶Fpg有关。Fpg是一种DNA修复酶，参与氧化损伤DNA或者诱突变剂损伤DNA的碱基切除修复。其他研究者在给予动物广泛剂量OTA处理后，在各种组织中均观察到DNA氧化损伤。抗氧化剂可以缓解OTA介导的DNA损伤，进一步说明OTA诱导氧化应激损伤。例如，抗氧化剂N-acetyl-L-cysteine(NAC)可以降低OTA引起的人近端肾小管上皮细胞HK-2 DNA和人胃黏膜上皮细胞GES-1氧化损伤[11, 12]。

蛋白质的羟基化作用通过多种氧化途径发生。羟基化是一种重要的蛋白质修饰方式，与蛋白(酶)功能改变、蛋白错折叠和蛋白分解有关。组织中蛋白羟基化水平增高与很多疾病有关。由于哺乳动物细胞中细胞骨架蛋白含量丰富，如actin，多受到各种ROS和低分子量反应性羟基的攻击[18]。目前，关于OTA对蛋白羟基化作用影响的报道不一致。给予F344大鼠每天0.3 mg/kg体重OTA喂养4周，在肝和肾没有观察到蛋白质氧化增加[17]。Wistar大鼠喂食OTA 289 μg/kg体重，90 d，在肝脏同样没有观察到蛋白质氧化增加[19]。但是，与之相反，Domijan等[20]在喂食Wistar大鼠每天0.5 mg/kg体重的第1、7、14和21天检测蛋白质氧化发现，大鼠的肝和肾中蛋白质羟基在第14和21天明显增加。体外研究也观察到了蛋白质的氧化形式。

自由基引起的反应中研究最广泛的是脂质过氧化作用，其副产物中，HNE、MDA、丙烯醛和巴豆醛则研究较多。这些反应性亲电子物质具有修饰DNA碱基的能力，引起突变性损伤，因此被认为与氧化应激脂质过氧化反应的致突变性和致癌作用有关。已经证实，癌症发生过程中HNE和MDA会升高[6]。研究发现，OTA诱导MDA形成。最初时，Rahimtula[21]研究小组发现，将OTA加入到肝细胞或肾细胞的微粒体中，可以刺激脂质过氧化反应，大鼠体内实验同样如此。另有研究报道，OTA-铁复合物刺激脂质过氧化反应[8]。另外，有研究证实，OTA诱导的脂质过氧化反应可以导致微粒体释放Ca2+[22]，给予动物模型不同的口服剂量OTA发现MDA生成增多，体外培养细胞给予OTA处理后可以检测到HNE-蛋白加合物。

2.1.3 生物反应 众所周知，ROS可以触发生物反应，例如激发和抑制信号通路和基因表达。这些生物反应可能参与了反应性化学物质的致癌机制。体内外研究表明，氧化应激作为信使参与OTA诱导的负面生物效应。例如，OTA诱导自由基生成，增加细胞膜Ca2+通透性[22]。

2.2 OTA抑制蛋白合成 体内外实验研究均发现，OTA可以通过抑制肽链的延长而抑制蛋白质合成，并且很多研究表明抑制蛋白合成与OTA的急性毒性作用有关。抑制蛋白质合成是OTA的一种主要作用，与抑制RNA和DNA的合成有关。最近的遗传毒理学研究报道，长期喂食大鼠致癌剂量的OTA可以明显降低RNA和蛋白的表达，进一步说明OTA具有抑制蛋白质合成的作用[23]。

2.3 OTA与细胞信号

2.3.1 丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases，MAPKs) 是信号级联反应的关键部件，涉及磷酸化激活的反应，调控信号从细胞膜到细胞核的传导。ERK、JNK和P38是主要的MAP激酶，调控哺乳动物细胞生理学的许多方面。一般认为，ERK负责调节细胞增殖，JNK和P38更倾向于参与应激反应和凋亡。体外实验研究发现，OTA诱导ERK1/2、JNK和P38磷酸化[24, 25]。喂养雄性大鼠致癌剂量OTA 7、21 d和12个月，OTA影响肾组织中MAPK的表达和磷酸化。经分析，ERK上游的效应器为胰岛素样生长因子(IGF-1)，(IGF)-PI3K-PKB 通路可能参与OTA介导的雄性大鼠肾毒性[26]。肾肿瘤中的信号级联作用已经广泛研究。一些学者发现细胞增殖、细胞存活、抗凋亡活性和肾肿瘤发展与IGF-1系统的刺激、蛋白激酶C活性的增加和MAPK-ERK的激活有直接关系。并且动物实验的结果也支持MAPK级联激活与肾肿瘤相关。

2.3.2 Ca2+动态平衡 Ca2+是重要的细胞信号，例如涉及钙调蛋白和蛋白激酶C的激活，且钙动态平衡失衡是毒素损伤的早期和关键事件。体外实验表明OTA影响细胞内的Ca2+平衡[22]。但是，体内实验只有有限的且不一致的关于OTA和Ca2+平衡的结果[27]。有研究报道，钙调素抑制大鼠肾皮质的DNA合成，并且抑制肝癌细胞的肿瘤活性[28]。

3 OTA诱发多种细胞效应

3.1 细胞毒性和细胞死亡 高浓度OTA引起强烈的氧化应激和抑制蛋白合成，从而导致细胞毒性和细胞死亡。众所周知，毒性作用可能诱发细胞的再生和增殖，这可能导致细胞转化和肿瘤的发展。总之，近期的研究表明组织再生和细胞增殖可能参与了OTA的致癌作用[29]。

3.2 凋亡 在一定水平上，氧化应激可以诱导程序性细胞死亡，即凋亡，是有别于坏死的积极过程。一些研究表明，OTA可以诱导体内外细胞发生凋亡。随着肿瘤的发展，凋亡的作用是难以定义的。通常认为凋亡去除异常细胞而阻止肿瘤的发展。但是，基于体外实验的研究结果，一些学者主张OTA的介导的细胞凋亡引起抗凋亡细胞的选择，这极有可能导致细胞转化为肿瘤细胞[14]。此外，因为坏死和凋亡刺激代偿细胞损失反应能力，导致细胞增殖和癌症的发展。

3.3 转化与增殖 除了导致DNA损伤，持续的低水平的氧化应激可以诱导细胞增殖。这最终可转换成基因突变的DNA损伤，从而导致细胞转化和肿瘤的发生发展[11]。

综上所述，OTA不是通过单一的、定义明确的机制发挥作用的，而是一个复杂的、相互联系的网络机制。抑制蛋白合成、氧化应激、特定信号通路的激活都参与了OTA的致癌机制。其中，关于氧化应激机制越来越受到人们的关注。一些专家认为，OTA介导的氧化应激在OTA诱导的肾肿瘤的发生中起着举足轻重的作用。总之，有力的证据表明OTA可以引起氧化应激反应，并且氧化应激参与OTA致癌。

[1] Internationalprogramme on chemical safety (IPCS), 2001. Safety Evaluation of Certain Mycotoxins in Food, WHO Food Additives Series 47, World Health Organization, Geneva.

[2] International Agency for Research on Cancer.Some Naturally Occurring Substances, Food Items and Constituents, Heterocyclic Aromatic Amines and Mycotoxins[J].Geneva: International Agency for Research on Cancer.IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, 1993, 56: 26-32 .

[3] National Toxicology Program.Toxicology and Carcinogenesis Studies of Ochratoxin A (CAS No. 303-47-9) in F344/N Rats (Gavage Studies).Natl Toxicol Program Tech Rep Ser, 1989, 358:1-142.

[4] DFG, DeutcheForschungsgemeinschaft List of MAK andBAT Values, Commission for the investigation of HealthHazards of chemical compounds in the work area, report no.39, Wiley-VCH, VerlagWeinheim，2003.

[5] Schwartz G G. Hypothesis: Does ochratoxin A cause testicular cancer[J]. Cancer Causes Control, 2002, 13(1): 91-100.

[6] Klaunig J E, Kamendulis L M.The role of oxidative stress in carcinogenesis[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2004, 44: 239-267.

[7] Valko M, Rhodes C J, Monco L J,etal. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer [J]. Chem Biol Interact, 2006, 160(1): 1-40.

[8] Omar R F, Hasino B B, Mejilla F,etal. Mechanism of ochratoxin a stimulated lipid peroxidation [J]. Biochemical Pharmacology, 1990, 40(6): 1183-1191.

[9] Faucet-Marquis V, Pont F, Stormer F C,etal. Evidence of a new dechlorinatedochratoxin A derivative formed in opossum kidney cell cultures after pretreatment by modulators of glutathione pathways: correlation with DNA-adduct formation [J]. Mol Nutr Food Res, 2006, 50(6): 530-542.

[10] KenslerTW, WakabayashiN, Biswal S. Cell survival responses to environmental stresses via the Keap1-Nrf2-ARE pathway [J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2007, 47:89-116.

[11] Cui J, Liu J, Wu S,etal.Oxidative DNA damage is involved in ochratoxin A-induced G2arrest through ataxia telangiectasia-mutated (ATM) pathwaysin human gastric epithelium GES-1 cells in vitro [J]. Arch Toxicol,2013, 87(10):1829-1840.

[12] Somy Yoon, Wei Tao Cong, Yeojin Bang,etal. Proteome response to ochratoxin A-induced apoptotic cell death in mousehippocampal HT22 cells [J]. Mutagenesis, 2007, 22(1): 35-42.

[13] Robbiano L, Baroni D, Carrozzino R,etal. DNA damage and micronuclei induced in rat and humankidney cells by six chemicals carcinogenic to the rat kidney [J]. Toxicology, 2004, 204(2-3): 187-195.

[14] Liu J, Wu S, Shen H,etal. OchratoxinAinduces DNA damage and G2 phase arrest in human esophageal epithelium Het-1A cells in vitro [J].J Toxicol Sci, 2015, 40(5):657-665.

[15] Liu J, Wang Y, Cui J,etal.Ochratoxin A induces oxidative DNA damage and G1 phase arrest in humanperipheral blood mononuclear cells in vitro [J]. ToxicolLett, 2012, 211(2):164-171.

[16] Kamp H G, Eisenbrandt G, Schlatter J,etal. Ochratoxin A: induction of (oxidative) DNA damage, cytotoxicity and apoptosis in mammalian cell lines and primary cells [J]. Toxicology, 2005, 206(3): 413-425.

[17] Kamp H G, Eisenbrand G, Janzowski C,etal. OchratoxinA induces oxidative DNA damage in liver and kidney afteroral dosing to rats [J]. Molecular Nutrition and Food Research, 2005, 49(12): 1160-1167.

[18] Dalle-Donne I, Rossi R, Colombo R,etal. Biomarkers of oxidative damage in human disease [J]. Clin Chem, 2006, 52(4): 601-623.

[19] Gagliano N, Donne I D, Torri C,etal. Early cytotoxic effects of ochratoxinA in rat liver: a morphological, biochemical and molecular study [J]. Toxicology, 2006, 225 (2-3): 214-224.

[20] Domijan A M, Rudes K, Peraica M.The effect ofochratoxin A on the concentration of protein carbonyls inrats [J].Arh Hig Rada Toksikol, 2005, 56(4):311-315.

[21] Rahimtula A D, Bereziat J C, Bussacchini-Griot V,etal. Lipid peroxidation as a possible cause of ochratoxin A toxicity [J].Biochemical Pharmacology, 1998, 37(23): 4469-4477.

[22] Khan S, Martin M, Bartsch H,etal. Perturbation of liver microsomal calcium homeostasis byochratoxin A [J]. Biochemical Pharmacology, 1989, 38(1): 67-72.

[23] Marin-Kuan M, Nestler S, Verguet C,etal. A toxicogenomics approach to identifynew plausible epigenetic mechanisms of ochratoxinAcarcinogenicityin rat [J].ToxicolSci, 2006, 89(1): 120-134.

[24] Wang Y, Liu J, Cui J,etal. ERK and p38 MAPK signaling pathways are involved in ochratoxin A-induced G2phase arrest in human gastric epithelium cells [J].Toxicol Lett，2012,Mar 7,209(2):186-192.

[25] Kumar R L, Ansari K M, Chaudhari B P,etal.Topical application of ochratoxin A causes DNA damage and tumor initiation in mouse skin [J]. Plos One. 2012; 7(10): e47280.

[26] Marin-Kuan M, Nestler S, Verguet C. MAPK-ERK activation in kidney of male rats chronically fed ochratoxin A at a dosecausing a signi cant incidence of renal carcinoma [J]. ToxicolApplPharmacol, 2007, 224(2): 174-181.

[27] Rached E, Hard G C, Blumbach K,etal. Ochratoxin A: 13-week oral toxicity and cell proliferation in male F344/n rats [J]. ToxicolSci, 2007, 97(2): 288-298.

[28] Tsurusaki Y, Yamaguchi M. Role of regucalcin in liver nuclearfunction: binding of regucalcin to nuclear protein or DNA andmodulation of tumor-related gene expression [J]. Int J Mol Med,2004,14(2):277-281.

[29] Stemmer K, Ellinger-Ziegelbauer H, Ahr HJ,etal. Carcinogen-specific gene expression profiles in short-term treated Ekerandwild-type rats indicative of pathways involved in renal tumorigenesis[J]. Cancer Res, 2007, 67(9): 4052-4068.

(2016-08-23收稿 2016-10-15修回)

(责任编辑 张 楠)

国家自然科学基金面上项目(基金代码 81171889)

刘 静，博士，讲师。

100039 北京，武警总医院 1.病理科，2.质量管理科；

3.050017 石家庄，河北医科大学病理研究室

张祥宏，E-mail：zhangxianghong2008@163.com

R114