花粉管通道法转Bar基因胡麻后代的分子检测

苏文杰

（通渭县鸡川镇政府，甘肃 定西 743300）

花粉管通道法转Bar基因胡麻后代的分子检测

苏文杰

（通渭县鸡川镇政府，甘肃 定西 743300）

以花粉管通道法转Bar基因胡麻T1代胡麻为研究对象，用CTAB法提取DNA，经PCR分别扩增外源基因Bar基因的片段，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测分析，筛选Bar基因成功整合到基因组的单株，结果在114个T1系亚麻植株中检测出5株含有Bar基因的阳性亚麻植株，转化率为4.4%。探讨了花粉管通道法转Bar基因在亚麻中的应用前景。

花粉管通道法；转基因；胡麻；PCR检测

1 前言

油用亚麻，又名胡麻，拉丁学名Linum usitatissimum，属于亚麻科亚麻属普通亚麻的一个变种，是一年生或多年生草本植物。油用亚麻是我国五大油料作物之一，主要分布在甘肃、内蒙古、山西、宁夏、河北、新疆及青海等省区。

利用转基因技术育种可以打破物种间的遗传障碍，实现优良目的基因的定向转移，同时具有后代易于稳定、育种周期短等优点，为作物育种和品质改良提供了新的途径。已报道亚麻遗传转化主要采用基因枪导入法和农杆菌侵染法，但这两种方法都需要经历组织培养的过程，具有实验设备配备要求高、操作复杂、周期长、成本高等缺点。花粉管通道法是利用植物授粉后形成的天然花粉通道，经珠心通道，将外源DNA携入胚囊，从而转化早期胚胎细胞的方法。它避免了繁琐的组织培养过程，操作简单、成本低廉，可直接用于常规育种。自花粉管通道法问世以来，已在水稻等多种植物的遗传转化中取得成功，但应用在油用亚麻的遗传转化尚未见报道[1]。

Bar基因能使植物抵抗如草丁膦等以PPT为活性成分的除草剂，具有PPT活性的除草剂具有输导型灭生性，杀草谱广，对植物的地上部分和地下部分均有枯杀作用，而且在土壤中易被代谢分解，残留期短，半衰期只有2～3 d。目前，Bar基因已导入水稻、玉米、小麦、大麦、烟草、马铃薯、番茄、高粱、燕麦、甘蔗、番术瓜、菜豆、豌豆、棉花等作物[2]。本论文以花粉管通道法导入Bar基因的T1代胡麻材料为研究对象，通过PCR分子检测手段筛选Bar基因成功整合到基因组的单株，并统计分析转化效率，为开展胡麻转基因育种后续研究奠定基础。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料

试验用花粉管通道法转Bar基因胡麻T0代由甘肃省农业科学院作物研究所胡麻课题组提供，播种后分单株取样检测。

2.1.2 主要试剂

PremixTaq DNA聚合酶、dNTP、DNAMarker均购自宝生物工程（大连）有限公司，PCR引物由Invitrogen公司合成。

2.1.3 主要仪器

台式冷冻离心机、基因扩增仪、凝胶成像仪、电泳仪及移液枪。

2.1.4 主要缓冲液配方

CTAB提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)，20 mmol/L EDTA (pH值8.0)，1.5 mol/L NaCl,2% CTAB(W/V)，4%PVP40(W/V)和2%巯基乙醇(V/V)，PVP和巯基乙醇使用前加入[3]。TE：10mmol/LTris-HCl（pH值8.0），1mmol/LEDTA。6琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液：0.25%溴酚蓝(W/V)，40%蔗糖(W/V)。1TAE电泳缓冲液：40 mmol/LTris-乙酸，1 mmol/LEDTA。

2.2 方法

2.2.1CTAB法提取DNA

取样：摘取T1代114株胡麻的幼嫩组织，然后分管冷藏。

2.2.2PCR扩增

以含有由CaMV35S启动子、Bar基因和NOS终止子组成的表达框的质粒pG4A作为PCR检测的阳性对照，未进行转基因操作的胡麻植株为阴性对照，水做空白对照，用Bar基因引物进行PCR扩增。

反应体系如下：

PCR循环参数：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃后延伸5 min，经32个循环后10℃保存。

2.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测

1.5%琼脂糖电泳点样总量为6 μL体系，加样顺序为1 μL溴酚兰+5 μL扩增样品。

3 结果与分析

3.1 结果

3.1.1PCR阳性植株的鉴定

为了验证Bar基因的导入与否，将T1代114株胡麻的幼嫩组织摘取分管冷藏，以阳性植株为对照进行PCR分析。从中提取DNA进行Bar基因的扩增，其结果如图1所示。

1005-2690（2017）03-0117-02

S512.1

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