鲍曼不动杆菌细胞膜屏障组成成分及透膜方法研究进展

杨相海，姜志辉，段欣冉，李健

(1广东药科大学中药学院，广州510006；2广州军区广州总医院；3广州市老年慢病患者合理用药重点实验室；4暨南大学药学院)

鲍曼不动杆菌细胞膜屏障组成成分及透膜方法研究进展

杨相海1,2,3，姜志辉2,3,4，段欣冉1,2,3，李健1,2,3

(1广东药科大学中药学院，广州510006；2广州军区广州总医院；3广州市老年慢病患者合理用药重点实验室；4暨南大学药学院)

鲍曼不动杆菌的细胞膜屏障是细菌产生耐药的重要原因。构成鲍曼不动杆菌细胞膜屏障的组成成分主要有脂多糖、外膜蛋白、外排泵、细胞质膜蛋白等。目前，针对上述结构研发的透膜策略包括破坏脂多糖稳定性、抑制外排泵、识别吸收系统、特洛伊木马法等。

鲍曼不动杆菌；细胞膜；抗生素；细菌耐药

鲍曼不动杆菌是一种条件致病菌，在医院ICU病房中普遍存在。1970年之前鲍曼不动杆菌对大部分传统抗生素保持敏感，如β-内酰胺类光谱抗生素、头孢菌素类及四环素类。然而，鲍曼不动杆菌有较强的环境适应能力和产生耐药性的能力，现已成为临床上最难治疗的致病菌之一[1]。多耐药鲍曼不动杆菌医院感染被不断报道，并表现出较高的致死率。目前对鲍曼不动杆菌保持较好敏感性的抗生素只有替加环素和多黏菌素，然而多黏菌素具有较强的肾毒性和神经毒性，限制其广泛使用[2]。耐替加环素类的鲍曼不动杆菌也时有被报道，新型抗生素的研发迫在眉睫。鲍曼不动杆菌作为革兰阴性菌，其细胞膜特殊结构导致一般化合物很难透膜进入细胞发挥作用，使得抗生素研发难度加大[3]。Magnet等[4]首次发现鲍曼不动杆菌有AdeABC外排泵，能将细菌体内摄取的抗生素泵出体外，降低细菌对抗生素的敏感性。因此，了解鲍曼不动杆菌的细胞膜结构及如何增加药物透膜量，对新型抗生素的研发意义重大。现就鲍曼不动杆菌的细胞膜屏障组成成分及透膜方法相关研究进展进行综述。

1 鲍曼不动杆菌的细胞膜屏障组成成分

鲍曼不动杆菌对抗生素的敏感性是由抗生素在细菌细胞膜之间的相向流动决定的[5]。鲍曼不动杆菌的细胞外膜主要由不对称的两部分组成，分别为脂多糖层和磷脂层，其能够阻挡大部分抗生素的吸收。细胞外膜中同时镶嵌了非特异性孔蛋白和特异性摄取通道[6,7]。含脂多糖的双分子层比普通双分子层更难被透过，只有疏水性化合物能缓慢通过。另外，由于孔蛋白较小，也限制了亲水性药物的摄取。而且，缓慢透过外膜的药物还会被多药主动外排转运蛋白进一步外排。多药外排转运蛋白结构和功能呈现为多样性，有些转运蛋白能将抗生素泵出内膜从而降低抗生素在细胞质中的浓度；一些转运蛋白将抗生素进一步从细胞周质外排到细胞外膜外；还有一些转运蛋白形成一个复合物，穿过细胞周质连接细胞内膜和外膜，使抗生素能够直接透过细胞膜。

1.1 脂多糖 虽然革兰阴性菌外膜结构相似，但由于孔蛋白的通透性存在差异，所以不同种类革兰阴性菌外膜的通透性也不同[3]。脂多糖双分子层化学结构和性质也影响膜通透性。脂多糖中脂质A包含N-酰基化和O-酰基化二氨基葡萄糖磷酸酯骨架结构。在鲍曼不动杆菌中脂质A通常被磷酸乙醇胺、半乳糖胺、六酰基化合物和七酰基化合物修饰[8]。两性分子和带电分子可能与脂质A和核心多糖相连，通过修改脂多糖双分子层中脂质和脂多糖让他们更容易透膜。最新分子动力学模拟系统对不对称脂多糖双分子层进行模拟[9,10]，外膜的内小叶由磷脂和一个类似细胞质膜物质组成，因此，脂多糖小叶的形状应与磷脂的小叶匹配。所以，含脂多糖的双分子层比单纯磷脂双分子层更无序、更薄。脂多糖双分子层的组分和硬度可能会影响两性和疏水性抗生素的摄取。

1.2 外膜蛋白 鲍曼不动杆菌外膜的组成和结构与大多数革兰阴性菌一样，约有160个不同的蛋白镶嵌在双分子层上，在摄取和输出不同化合物和多肽上发挥重要作用。鲍曼不动杆菌的外膜蛋白主要有OmpA、OprD、CarO等。

1.2.1 OmpA蛋白 OmpA蛋白在营养摄入和维持外膜结构上发挥重要作用，与大肠杆菌不同，鲍曼不动杆菌的主要外膜蛋白不是高通透性三聚体微孔蛋白OmpC、OmpF，而是非特异性低通透性孔蛋白OmpA-AB，其只能通过200 D以下的分子[6]，这导致鲍曼不动杆菌外膜渗透性只有大肠杆菌的1%～8%。在充足的营养条件下，OmpA蛋白并不影响鲍曼不动杆菌的生长。还有研究[12]表明，OmpA蛋白具有免疫原性、致病性、免疫保护等作用。

1.2.2 CarO蛋白 除了非特异性孔蛋白，鲍曼不动杆菌还使用特异性孔蛋白摄取小分子物质，大量的特异性孔蛋白在营养匮乏的环境下有较大优势，但在营养充足时作用有限。鲍曼不动杆菌的CarO蛋白与铜绿假单胞菌的OprD蛋白类似，均为碳青霉烯类抗生素通过细胞外膜的主要通道。在耐碳青霉烯类抗生素的鲍曼不动杆菌中，往往可发现CarO蛋白表达下调或丢失[13]。

1.2.3 OprD蛋白 鲍曼不动杆菌的孔蛋白OprD与铜绿假单胞菌的孔蛋白OprD表现出49%的相似性，有较高同源性。而铜绿假单胞菌的OprD是碳青霉素类的通道蛋白，但鲍曼不动杆菌的OprD并没有表现出该功能，而是与铜绿假单胞菌的OprQ功能更接近，能使鲍曼不动杆菌在低铁、低镁、低氧的环境下继续生存。作为一个特异性通道蛋白，OprD不能使亚胺培南、美诺培南或氨基酸通过，但表现出较低的单通道导电性。这些特征能够帮助鲍曼不动杆菌更好适应低铁和低镁环境[14]。

1.3 外排泵 目前发现的革兰阴性菌皆含有最少一个外排泵。鲍曼不动杆菌基因编码了7个RND类型的外排泵，比较常见的有AdeABC、AdeIJK、AdeFGH等。

1.3.1 AdeABC AdeABC是第一个被研究者发现的鲍曼不动杆菌外排泵，该外排泵存在于大部分鲍曼不动杆菌中，包括耐药鲍曼不动杆菌和敏感鲍曼不动杆菌。AdeABC参与多重耐药机制，是多重耐药鲍曼不动杆菌产生的重要原因。在一般环境下，鲍曼不动杆菌中的AdeABC低表达或不表达，AdeSR复合调控基因突变或序列插入可增强AdeABC的表达，使鲍曼不动杆菌的耐药性变强[15]。AdeABC结构基因由AdeA、AdeB、AdeC三个相连的基因组成，分别编码AdeA膜融合蛋白、AdeB转运蛋白、AdeC外膜蛋白。AdeB是位于内膜的转运蛋白，AdeA是定位在内膜的膜融合蛋白，AdeC是一种外膜通道蛋白[4]。AdeB可在AdeA和AdeC的帮助下将基质排出外膜。研究[16]表明，AdeABC对氨基糖苷类、溴化乙锭、喹诺酮类、甲氧氨苄嘧啶、四环素类、红霉素、氯霉素和生物灭菌剂均有外排作用。

1.3.2 AdeIJK AdeIJK是第二个被发现的鲍曼不动杆菌外排泵，广泛存在于大部分鲍曼不动杆菌中，参与多种抗生素的外排。AdeIJK一般处于低表达，其表达水平远低于AdeABC，AdeIJK高表达对细菌本身有毒性。AdeIJK由AdeI膜融合蛋白、AdeJ转运蛋白、AdeK外膜蛋白组成，与其他RND外排泵蛋白的同源性为46%～62%。研究[17]显示，AdeIJK可导致细菌对β-内酰胺类、四环素类、氯霉素、红霉素、氟喹诺酮类、甲氧氨苄嘧啶、十二烷基硫酸钠耐药。

1.3.3 AdeFGH 鲍曼不动杆菌的AdeFGH外排泵被发现的时间相对较晚。AdeFGH过表达是鲍曼不动杆菌产生多重耐药的重要原因。近年来对AdeFGH在耐药方面的研究较少。有学者[18]发现AdeFGH的调控基因AdeL发生突变能诱导其高表达。AdeFGH过表达可导致鲍曼不动杆菌对氯霉素、克林霉素、替加环素、氟喹诺酮类、甲氧苄氨嘧啶、磺胺甲恶唑等抗生素产生耐药[17]。

1.4 细胞质膜蛋白 由于细菌将药物排出细胞外膜后才展现出耐药性，所以目前研究主要集中在多蛋白外排泵，关于将药物从细胞质分泌到细胞周质的单组分蛋白的研究较少。少量单组分转运蛋白失活通常对抗生素敏感性没有大影响，但多个单组分转运蛋白失活可使外排系统功能显著减弱。特定的药物转运蛋白，如TetA可使细胞膜的外排能力相加或相乘，具体取决于其与细胞膜中表达的转运蛋白的组合[19]。单组分和三组分转运蛋白共表达可对共享药物协同外排，降低细菌对药物的敏感性[20]。单组分转运蛋白多属于小多重耐药家族(SMR)、主要易化超级家族(MFS)或多药及毒性化合物外排家族(MATE)。在鲍曼不动杆菌中，SMR的转运蛋白AdeS、MFS的CraA和AmvA、MATE的AbeM是典型代表[21,22]。

2 鲍曼不动杆菌细胞膜透膜方法

目前比较主流的透膜方法有破坏脂多糖稳定性、抑制外排泵、识别吸收系统、特洛伊木马法等，这些方法均能使抗生素更好透过细菌膜，但都存在一定局限性，这需要我们在此基础上进一步优化，探索新的、更有效的方法。

2.1 破坏脂多糖稳定性 离液序列高的抗生素能促进亲水性化合物扩散在脂质双分子层中，可破坏脂多糖稳定性从而突破膜屏障。使用三羟甲基氨基甲烷或乙二胺四乙酸可使大量脂多糖溶解在介质中，外膜中脂多糖减少的部分会被磷脂替代，使亲脂性化合物更容易通过[23]。然而，离液序列高的化合物有明显的生物膜毒性，只能停留在实验室中使用。

多肽类药物多黏菌素B和多黏菌素E含有带正电荷的游离氨基，能与鲍曼不动杆菌细胞膜磷脂中带负电荷的磷酸根结合，导致细菌外膜脂多糖层通透性增加，使多黏菌素更容易进入细胞周质；多黏菌素的“自我促进吸收”功能使其更容易通过细胞周质达到细胞内膜；多黏菌素上的脂肪酸链使其更容易透过内膜，进而发挥抗菌作用。而且，多黏菌素与其他抗生素联合可增强细菌对抗生素的敏感性。有研究[24]显示多黏菌素与美诺培南、替加环素、利福平联合均表现出较好的协同作用。

另外，中药小檗碱作为一种苯并异哇琳类季铵型生物碱，也能影响细胞膜通透性，造成钙离子流失，还能抑制细菌DNA复制、RNA转录和蛋白质合成[25]。

2.2 抑制外排泵 外排泵过表达可使大部分抗菌药排出，引起鲍曼不动杆菌产生多重耐药。目前报道比较多的外排泵抑制剂有PaβN、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、羰基氰氯苯腙(CCCP)、利血平等。PAβN和NMP均可抑制鲍曼不动杆菌AdeABC外排泵系统中AdeB的表达，导致AdeABC外排泵外排能力减弱，提高了细菌对抗生素的敏感性，其中NMP的抑制活性较PaβN更好[26]。CCCP是一种强解耦联剂，其能自由扩散在磷脂膜两侧，破坏质子跨膜电化学梯度，阻断转运蛋白的能量供应，从而降低外排泵系统的主动外排能力。利血平是一种吲哚型生物碱，临床用于治疗高血压；作为外排泵抑制剂，其主要对MFS和ABC类型外排泵起抑制作用，但该药高浓度时易引起神经毒性，限制了其使用。外排泵抑制剂能降低抗生素耐药率，但其毒性往往较大，应用受到限制[27]。

2.3 识别吸收系统 大部分“难渗透”革兰阴性菌依赖于特定的孔蛋白和主动吸收系统摄取营养物质，以满足其代谢需求，最大限度提高增殖率。根据孔蛋白和吸收系统的特点，可以对抗生素进行修饰，从而使它们能够顺利通过特异性识别系统。Isabella等[28]采用分子动力学模拟系统描述天然底物和碳青霉烯类抗生素通过OprD通道时的分子特征，从而确定抗生素通过特定通道的最适分子结构。提高抗生素吸收速度可抵消外排的影响，从而提高抗生素在细菌体内的蓄积量，增强细菌对抗生素的敏感性。在改造化合物结构使其符合透膜要求时，也需要保持它的抗菌特性，但目前很难找到同时符合以上两种要求的方法。相信识别吸收系统将成为未来抗生素研发的重点。

2.4 特洛伊木马法 特洛伊木马法主要是利用铁载体结合抗生素的策略。铁载体结合抗生素可通过各种铁吸收系统被运送到细菌细胞周质和细胞质[29]。有学者[30]发现一种常见的革兰阴性细菌铁载体运输通路：外膜转运蛋白结合Fe3+-铁载体复合物跨外膜进入细胞周质，在TonB蛋白的帮助下固定在细胞质膜上。这个过程是由细胞质膜电位驱动的。细胞周质中的Fe3+-铁载体固定在载体蛋白质上，通过同源的ABC转运蛋白进入细胞质递送Fe3+-铁载体，或还原铁在细胞周质中被卸载。Basilea是目前惟一进入临床试验的化合物[31]，这种单环β-内酰胺类化合物连接一种β共轭二氢吡啶酮铁载体，具有较强的抗多药耐药革兰阴性菌的活性。

总之，鲍曼不动杆菌细胞膜是阻碍抗生素进入的主要屏障，对细胞膜通透性进行研究有助于提高细菌体内抗生素的蓄积量，从而提高细菌对抗生素的敏感性。后续研究可集中在改进透膜策略方面，在保证化合物较高透膜能力的基础上降低其毒性。

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