单细胞测序技术及其在肿瘤研究和临床诊断中的应用

周莹黄华艺，2★

单细胞测序技术及其在肿瘤研究和临床诊断中的应用

周莹1黄华艺1，2★

肿瘤组织的异质性是肿瘤的一个重要特征。肿瘤细胞均一性的缺乏使得肿瘤靶向治疗的难度加大。因此，鉴别肿瘤细胞的异质性是一个重要工作。单细胞测序技术（single-cell sequencing，SCS）是通过下一代测序手段观察单个细胞的基因组序列信息，从而获得细胞间遗传物质和蛋白质信息的差异，因此能够更好地理解单个细胞在其微环境中的功能。通过对单个肿瘤细胞全基因组、转录组以及细胞表观遗传基因进行测序，瘤内异质性的复杂机制可被揭示，从而改善肿瘤诊断、转归预测和治疗效果的监测。本文对单细胞测序技术的发展、检测原理和检测流程、存在的问题及其在肿瘤研究中的应用以及该技术在临床上的潜在价值进行了概述。

单细胞测序；下一代测序；基因组；肿瘤；异质性

肿瘤是机体在各种致癌因素作用下，遗传物质受损导致对特定细胞失去正常生长调控，继而引起其克隆性异常增生。恶性肿瘤细胞通过对自身不断“改良”，可以产生许多基因突变和致病性表型，以适应宿主体内复杂的肿瘤微环境，甚至肿瘤内的单个细胞组织表现出独特的表型，即瘤内异质性（intratumoral heterogeneity）［1］。这代表着不同的肿瘤细胞之间致病潜力存在差异，其中某些细胞可能造成更大的威胁，具有更强的转移或侵袭能力或者更容易产生耐药性。然而，对于肿瘤细胞亚群分子层面的数据，尤其是对细胞异质性的信息挖掘和认识仍然非常有限。

细胞异质性是肿瘤研究和诊断治疗中亟待解决的关键问题，单细胞测序技术（single cell sequencing，SCS）是一种理想的研究肿瘤复杂性的方法。通过获取特定阶段的单个肿瘤细胞的动态基因组（deoxyribonucleic acid，DNA）、转录组（ribonucleic acid，RNA）数据以及细胞表观遗传信息，可用于构建与肿瘤发生、发展和转移以及产生耐药性等机制相关的遗传图谱，为临床探索有价值的诊断或预后生物标志物以及分子治疗靶标［2］。在这篇文章中，我们将对SCS技术进行介绍，并对其在单个细胞的肿瘤活检以及液体活检中的应用进行总结。

1 单细胞测序技术简况

测序技术经历了低通量到高通量的时代变革，能够对几十万到几百万条DNA分子同时测序，每个运行可精确读出数以千亿计的碱基，从而实现快速、高效、低成本的基因组测序。受益于测序技术的发展，对细胞的分子研究逐渐由混合细胞群样本发展到单个细胞样本。下一代测序（next generation sequencing，NGS）技术的发展为实现全基因组单细胞测序（genome-wide single-cell sequencing）提供了新的可能［3］。2009年研究人员采用mRNA全转录组测序方法（mRNA-Seq wholetranscriptome analysis）对小鼠单个四细胞期胚胎的卵裂球转录组进行单细胞水平分析，其技术革新使全长互补DNA序列（complementary DNA，cDNA）的捕获率提高到64%，同时在cDNA扩增时放宽对片段长度的限制［4］。2011年由Cold Spring Harbor实验室和MD Anderson癌症中心开发并报道的一种肿瘤研究新方法SCS技术，能够对一个单细胞核中基因拷贝数目进行准确定量［5］。肿瘤细胞基因组部分被删除或者扩增，可以引起关键基因的缺失或者表达过量，继而干扰正常细胞生长。利用SCS技术能分析基因拷贝数目，从而进一步了解恶性肿瘤的细胞生物学机制。同时该方法解决了传统癌症基因组研究的一系列问题，如混合样品测序无法判断具体突变的来源及发生频率；无法解释肿瘤发生、发展以及演化过程中的细节；难以辨别主动突变或被动突变；目的细胞系测序时无法排除体外培养所导致的新突变干扰等［5］。2013年，研究人员首次利用肿瘤病人单个外周血循环肿瘤细胞（circulation tumor cell，CTC）进行全基因组、外显子组测序，为无创肿瘤诊断和监测提供了一种新的技术手段［6］。

2 单细胞测序技术的原理

单细胞测序主要包括单细胞基因组测序、转录组测序和表观遗传测序，这3种测序类型各具特点和优势，可以从不同角度揭示细胞各个阶段的功能和特性。全基因组测序是对目的细胞的全部基因组序列进行非选择性、均匀扩增，随后利用外显子捕获技术进而使用高通量测序的过程。转录组测序则是获取特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本，尤其适用于具有高度异质性的干细胞及胚胎发育早期的细胞群体的研究。以NGS为基础的各种表观遗传学测序可揭示基因调控的不同方面，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质结合结构和调节蛋白、染色体的空间结构与空间相互作用形成转录复合物的组分［7-9］。表观遗传改变是可逆的，并决定基因表达和负责细胞的异质性。

3 单细胞测序技术的流程

细胞测序主要涉及4大步骤，包括单细胞分离、核苷酸序列（DNA或RNA）扩增、基因测序和数据分析。

3.1 单细胞分离

进行单个细胞研究，首先要将目的细胞从生长环境中完整分离。第一类是基于细胞培养的分离法，此类方法无需特殊设备、成本低廉，属于非直观下分离细胞。但存在操作耗时、低通量，易造成分离错误或细胞丢失、不能靶向筛选细胞等弊端。第二类则是基于仪器的分离法，仪器方法可到达更高的精确度和细胞获取率，目前在科研和实际工作中普遍采用此类方法进行细胞分选。

我们对一些比较成熟的和新发展的仪器分离技术进行介绍，并概述其优点和局限性，实际工作中可根据具体的需求来选择适合的方法进行单细胞分离。显微操作法是应用较普遍的直视分选细胞技术，成本较低。但受通量低、人力投入大、容易对目的细胞造成机械性损伤等因素的制约，不利于大规模应用和商品化。另一个直视分离技术是激光捕获显微切割术（laser capture microdissec-tion，LCM）通过利用激光束使覆盖于组织切片上的透明膜熔化，冷却后目的细胞被固定于黏附膜上，从而实现细胞分离。该方法的优势在于能够在显微镜下准确而快速地获取单一细胞亚群或者单个细胞，解决了组织中细胞异质性的问题。但是存在成本较高、通量低、不能自动化的缺点。此外，LCM的技术缺陷还包括操作过程中细胞核容易被刨切而导致染色体片段丢失；精确度有限，切割过程中可能会掺入相邻细胞的原生质组分或损伤细胞核，而且其RNA多已降解，因此不适用于转录组学分析［10］。

目前单个肿瘤细胞分离通常是通过磁珠激活细胞分选（magnetic-activated cell sorting，MACS）或荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting，FACS）技术进行。这两种分离方法的成本较高，但是能满足高通量、自动化的要求。免疫磁珠分离法（immunomagnetic separation，IMS）属于MACS技术，即利用细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合。在外加磁场中，与磁珠相连的带有表面抗原的细胞被吸附而滞留在磁场中，不能与磁珠连接的细胞不在磁场中停留，从而使目的细胞得以快速分离［11］，但操作方法相对复杂。

荧光激活细胞分选技术是目前应用最多的单细胞分离方法，可对单个细胞进行高效和快速分离。FACS平台通过依靠荧光标记信号结合光散射分析参数，对具有异质性的肿瘤组织的单个细胞进行挑选和分析。该法不仅具备高通量的优势，而且可对具有不同表征（如大小、粒度、特异性抗原标记、同位素标记等）的靶细胞进行识别和分离［12］。其最大的缺陷是分选时需要大量的细胞，因此在制备大量细胞悬液的过程中可能降低低丰度细胞的获取率；同时FACS所检测的荧光信号相对较低，部分低表达的标记可能检测困难，存在特定细胞类型丢失的风险；此外，细胞的高速流动可能造成机械性损伤。

另一个新发展的微流控技术（microfluidics）则是通过人为控制流体流动来实现在微尺度上对目的细胞进行分离，主要利用流控通道具备的多种功能对细胞进行分选，如通道本身具有可调节的直径（10～100 μm）和多种功能性修饰（如捕获分子、抗体、电极等）。同时微流控装置的细胞污染率低，对样本和试剂损耗少，并且在降低单细胞测序的噪声以及提高基因组扩增一致性方面具有优势，已有相应的商业化平台在推广应用［13］。

3.2 核苷酸序列（DNA或RNA）扩增

一个正常的二倍体人体细胞的DNA和RNA含量为匹克（picogram，pg）水平［14］，因此SCS技术面临的主要技术挑战是单个细胞的DNA或RNA含量远远低于目前任一可用测序平台的检测阈值。为了克服这种局限性，必须对要检测的单细胞中分离的核酸进行放大。同时在建库时的文库分子仅有少量可在Floecell表面生成簇，并被测序检测到，因此至少要有上万倍到几十万倍的扩增效率，才能保证大部分的片段可被检测到，并且满足覆盖度高和低偏倚的要求。因此在测序之前，需要进行全基因组核苷酸扩增（genome-wide nucleotide amplification），包括全基因组扩增（wholegenome amplification，WGA）和全转录组扩增（whole-transcriptome amplification，WTA）。

3.2.1 全基因组扩增（WGA）

其目标是在没有序列偏向性的前提下大幅增加DNA的总量。一些基于PCR的方法可用于WGA，主要包括：基于热循环以PCR为基础的扩增技术，如退行性寡核苷酸PCR（degenerative-oligonucleotide PCR，DOP-PCR）；基于等温反应不以PCR为基础的扩增技术，如多重置换扩增法（multiple-displacement-amplification，MDA）以及基于多重退火环状循环扩增法（multiple annealing-and looping-based amplification cycles，MLBAC）。

DOP-PCR是SCS最初常用的技术，由于会产生非特异扩增且扩增效率不高（15%），因而应用受限［15］。MDA作为最常用的技术一直沿用至今，能对全基因组进行高保真的均匀扩增，扩增出10～100 kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因组序列。主要依赖于两种类型的DNA聚合酶，包括phi29 DNA聚合酶和Bst大片段DNA聚合酶。不仅可以结合由单引物启动的滚环扩增反应所产生的串联产物，也可以使新合成DNA片段位移替换之前的DNA片段，形成一种反复分支结构，进而引起链位移扩增出大段的DNA。MDA与基于PCR的传统WGA方法相比，其优势包括Phi29DNA聚合酶具有在较低和恒定的温度条件下催化DNA延伸反应、可加工较长扩增产物和高效率扩增的能力。MDA采用的是指数扩增法，可以实现从单个细胞基因组或外显子组中获得较高的覆盖度（＞90%）。但是MDA也存在一些缺点，特别是显著的非特异性扩增。另外就是全基因组覆盖度不均匀；等位基因丢失率高（可高达65%）；污染或干扰；随机引物与模板结合能力差异导致的扩增偏倚［16-17］。针对MDA潜在的污染问题（包括外源性或交叉污染），目前主要采取的改进措施是将荧光标记（例如SYBR Green）掺入反应体系中，以便对扩增过程进行可视化的荧光监测。该技术已成功应用于肿瘤单细胞测序［16-18］；另一项极具创新性的技术MALBAC是由哈佛大学谢晓亮团队研发［3，19］。与以前的技术相比，MALBAC的最大优势是采用线性扩增方式。其核心技术在于通过五轮MDA预扩增得到完整扩增产物；增加退火步骤达到链内杂交自我锁定，形成闭合的环状分子，避免指数扩增；再通过常规PCR进行扩增。由于此时的模板更加均一，则可达到低偏倚的目的。MALBAC技术将单细胞全基因组测序的精确度大幅度提高，以至于能够发现个别细胞之间的遗传差异。在25×测序深度下，MALBAC的覆盖度可达93%，而MDA覆盖度为73%，因此其在WGA中显示出扩增一致性好、偏倚少、效率高的特点。另外，MALBAC对单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）等位基因检出率高（可达70%），能精确地检测拷贝数变异（copy number variations，CNVs）、单核苷酸变异（single nucleotide variations，SNVs）、插入/缺失（insertions and deletions，INDELs）变异等。其缺点则是可能出现较高的假阳性率［20］。MDA和MALBAC技术各有特点，MDA扩增效率更高，实验方法简单，而MALBAC则扩增均一性更好，但扩增DNA的量相对较少，即扩增效率相对较低。

3.2.2 全转录组扩增（WTA）

多聚腺苷酸化mRNA在WTA初始阶段反转录，以Oligo-dT引物连接到一个接头序列去进行选择性扩增。通过Oligo-dT锚定法和模板转换法产生cDNA为下一步测序做准备。目前采用的WTA主要基于传统PCR、改良PCR（modified PCR）、体外转录（in vitro transcription，IVT）以及Phi29 DNA聚合酶介导的RNA扩增方法［21-22］。

3.3 基因测序数据的生物信息分析

对高通量数据的精准解读是基因测序和精准医疗的关键。单细胞数据分析的基本流程与传统序列分析相似，数据分析前首先要移除接头序列（adapter）、连接序列（linker）、标签序列（barcodes）、低质量碱基和污染DNA。然而两者间具有显著差异，传统拼接方法是建立在一定的假设之上，如嵌合序列比例较少，读取深度随基因组呈泊松分布等。而单细胞数据由于表现出不均匀的覆盖度和高比例的嵌合序列，则需要采用不同的分析方法进行数据预处理。一种方法是通过实验方法或计算机算法将核酸文库“标准化”，以降低扩增偏倚性；另外一种方法是将亲缘关系很近的单细胞测序数据进行混合分析。从偏倚性的角度来看，混合分析可以显著地提高样品的平均覆盖度。同时生物信息学分析软件也为数据分析提供了极大的便利，如SmashCell、Velvet-SC和SPAdes软件等都能在一定程度上克服单细胞数据覆盖度不均的问题，高效地完成序列拼接与测序数据分析［23］。

4 单细胞测序技术在肿瘤研究中的应用

迄今为止使用的测序材料无一例外都是数百万甚至更多细胞的混合DNA样本。因此测序结果通常表现出这些细胞“整体”表征，是一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息。然而，由于细胞异质性的存在，表型相同的细胞遗传信息可能存在显著差异。很多低丰度的信息，如只存在于少数细胞（如早期癌细胞）中的突变，将会在“整体”表征的平均化过程中稀释或丢失［24］。与传统的全基因组测序相比，SCS不仅测量基因表达水平更加精确，而且还能检测到微量的基因表达或罕见非编码RNA，其优势是全方位和多层次的。因此利用SCS技术深入地研究恶性肿瘤，可发现导致恶性肿瘤发生和演变的各种基因变异、肿瘤异质性、耐药性等，从而帮助我们在个体水平上认识恶性肿瘤的发生、发展及进化。

5 单细胞测序技术在肿瘤检测中的临床应用

5.1 SCS技术与肿瘤相关基因变异的检测

肿瘤的发生是一个多基因异常表现的疾病过程，最终导致一个正常的细胞表型转变为一种异常的细胞表型，即肿瘤细胞。识别具有不同遗传变异性的肿瘤类型和不同的肿瘤分期（即肿瘤发生、转移、化疗抵抗），有助于我们更好地理解肿瘤的发展和演化的机制以及为肿瘤的预防与治疗提供新策略和分子靶点［25］。

转录组和表观基因组测序数据对于肿瘤相关畸变的发现也很重要，例如，结直肠癌CTCs的转录组分析表明，由于肿瘤相关的转录下调与发挥“stemness”作用的基因（如CD166和CD26）具有相关性，CTCs可能代表一种休眠状态。此外，结直肠癌CTCs的基因组分析发现，一些在肿瘤细胞中低表达的基因往往在调控细胞间接触（cellcell contact）和动力方面起作用，而高表达的基因如CD47可协助肿瘤细胞逃避免疫杀伤［26］。一些基因组分析还发现在正常细胞功能中发挥重要作用的基因，如Septin 9（SEPT9）、POU4F1和核仁蛋白4（nucleolar protein 4，NOL4）等存在肿瘤表观遗传修饰成分，如CpG岛甲基化谱的改变［27-28］。

5.2 SCS技术与肿瘤细胞谱系树的重建

肿瘤的演化通常涉及遗传变异的积累，可以扰乱正常细胞的功能并促进正常表型向肿瘤表型转化［29］。获取这些遗传变异信息，包括时间和空间表达方面的数据，将可以重建肿瘤细胞谱系树。以此用于分析肿瘤演化的过程并且为疾病的诊断和治疗提供新的见解。目前通过利用SCS平台以及其他测序数据，已经开发了各种模型来构建肿瘤细胞谱系树。但是，这种生物信息学方法受到现有的SCS技术精确度的局限，包括现用的测序数据运算方法以及测序过程中产生的高错误率［30］。

5.3 SCS技术与肿瘤的诊断和治疗

在肿瘤发生发展过程中积累的遗传变异也可以影响肿瘤细胞对治疗的反应。SCS技术可以识别肿瘤诊断和个性化治疗相关的标志物［31-32］。各种肿瘤相关的基因突变已在临床应用，并作为特定类型肿瘤诊断的生物标志物，包括黑色素瘤BRAF基因突变、结肠癌的KRAS基因突变、非小细胞肺癌的EGFR基因突变［32］。但是，这些生物标志物仅仅用于提示存在发生相关肿瘤的风险，对于明确诊断则需要建立更详细和全面的分析。因为迄今为止尚没有发现某个单一突变与某个特定的肿瘤类型、发展阶段或者预后存在绝对的关联。例如，已在许多宫颈癌患者中观察到NOL4基因和脂肪瘤HMGIC融合伴侣蛋白4（lipoma HMGIC fusion partner-like protein 4，LHFPL4）基因存在高频甲基化［33］，但是仍有少数患者是没有检测到甲基化修饰的，如果仅依靠这些标记做为诊断依据就会导致漏诊。

此外，我们除了关注SCS技术为精确诊断带来的益处，还关注它在精准治疗中的重要作用。SCS技术可以为靶向药物的选择提供参考。从理论上说，修复肿瘤相关的遗传变异可以使肿瘤表型重新恢复成正常表型。多数靶向药物可以抑制异常基因的功能，因此可能给个体化肿瘤治疗带来益处。如，治疗恶性血液病的组蛋白去乙酰化酶抑制剂、治疗黑色素瘤的BRAF抑制剂以及治疗乳腺癌的PARP抑制剂等［32］。但由于肿瘤异质性的问题，不同靶向药物针对的肿瘤类型不同，甚至相同的肿瘤类型的靶向药物也不尽相同。而且在治疗中可能产生原靶向位点产生耐药性或出现新变异的问题。因此，基于精准检测下的靶向药物选择可以为患者带来最大益处，体现个性化治疗的价值［34］。

通过SCS技术可以揭开不同的肿瘤类型和阶段的遗传变异的差异，有助于制定个性化治疗方案和及时调整治疗策略。NUC-Seq是一种可以基本实现对单个细胞完整基因组进行完全测序的新的测序方法［35］。当细胞准备分裂时，细胞核内DNA会进行复制。通过筛选从而仅仅对新生的“双”核进行测序。NUC-Seq可以利用此类复制，获得比之前大部分的测序技术更低的测序错误率，可以将肿瘤的基因组异质性检测出来。研究人员运用NUC-Seq技术对乳腺癌患者进行单细胞基因组测序时发现，不同亚型的乳腺癌存在遗传变异的差异。在肿瘤进化中，三阴乳腺癌患者的肿瘤细胞变异率较高，而雌激素受体（ER）阳性患者的变异则相对稳定，因此ER阳性患者的治疗效果相对较好［36］。研究还发现基因重组等结构改变主要出现在乳腺癌早期且保持相对稳定的状态，而点突变则伴随整个肿瘤进化过程并导致大量基因多样性出现［35，36］。

5.4 SCS技术与外周血单个CTC在预测肿瘤转移和进展中的应用

SCS技术除了在肿瘤组织的检测上具有优势，还在CTCs研究方面显示出重要作用。CTCs是指由实体瘤病灶（原发灶或转移灶）释放进入外周血循环的肿瘤细胞，在外周血中检测到肿瘤细胞提示肿瘤远处转移的可能性［36］。但肿瘤患者血液中肿瘤细胞数量很少，传统研究往往需要建立在大量细胞的基础上才能进行。CTCs的全基因组测序可作为肿瘤诊断和评估预后的一种非侵入性的方法［37］；WGA及全基因组测序技术可对原发性肿瘤、CTCs、转移性肿瘤细胞进行分离，并揭示细胞之间基因组的联系。与肿瘤组织相比，血液样本易于获取、创伤性小、可反复采集，因此可作为肿瘤“液体活检”样本。

全基因组转录水平的单细胞RNA测序方法（single-cell RNA sequencing，Smart Seq）已应用于单个黑色素瘤细胞的不同的基因表达方式的分析，促进CTCs基因生物标志物的鉴定［38］。采用靶DNA测序（targeted DNA sequencing）方法观察到结肠癌的原发性肿瘤细胞和CTCs中存在不少类似的驱动突变，这表明CTCs的基因组分析可以代表肿瘤进化的突变方式［39］。而运用MABLC技术对肺腺癌和小细胞肺癌患者的单个CTC进行WGA和深度测序，检出特征性的与肿瘤相关的SNVs和INDELs等变异［6］。同一患者的不同CTCs的全基因组CNV具有高度一致性，且与其转移瘤的CNV一致，提示CNV与肿瘤的转移密切相关；在不同的肺腺癌患者中CTCs的CNV具有高度的相似性，说明特定的CNV与肿瘤的形成与转移有关。此外，小细胞肺癌患者与肺腺癌患者之间的CNV明显不同，提示不同的肿瘤来源是不同的变异造成的。另外，在肺腺癌患者的肝脏转移灶中观察到肿瘤表型转变为小细胞肺癌，以此为依据采用标准化的小细胞肺癌方案疗效显著，这提示治疗方案可基于CTCs中CNV的改变而调整。在治疗过程中，还观察到CTCs中的SNVs/INDELs会改变，而CNV模式保持相对稳定［6］。因此，SCS技术可以为肿瘤诊断和治疗以及预后观察提供分子层面相对明确的数据信息。

6 小结

单细胞测序技术提供了一个前所未有的肿瘤研究方法，允许对存在异质性的肿瘤细胞群之间的进行单细胞水平分析。单细胞测序数据将提高我们对肿瘤发病机制的认识，并改进诊断和治疗的方法。此外，单细胞测序所需试剂、设备和生物信息学算法等，均在不断完善，使得SCS平台的力量和功能逐渐增强。改进的SCS技术将减少甚至消除这些挑战从而获得更精确的测序数据，测序数据与病理特征之间的关系将更加明确。

目前单细胞测序技术还在发展阶段，而且因为其涉及到NGS技术，故有些技术问题仍需解决：①目标细胞的提取问题：要能够准确筛选目标细胞，如正常细胞或肿瘤细胞不被周围细胞污染；②扩增失败和等位基因脱扣；③PCR产生的非特异产物问题；④NGS的重复性问题等。此外，虽然基因组测序的成本一直在不断下降，但是单个细胞基因组测序以及由此对复杂生物信息进行分析的成本依然是惊人的。同时，对个体细胞进行分析的新技术不断涌现，但技术缺陷仍然存在。例如，MALBAC等所得到的检测结果的可信度有多高（假阳性率高）。例如，由于染色体数目异常导致很多肿瘤细胞是非整倍体细胞，而NUC-Seq技术可能只局限用于检测不含非整倍体细胞的肿瘤。

在研究肿瘤发生发展的道路上，单个细胞测序技术的出现无疑是一个里程碑。借助这一技术，我们可以对不同患者的肿瘤细胞基因组进行比较，或者对同一患者在解剖学上相互独立的器官、组织的肿瘤细胞进行比较，甚至可以比较同一肿瘤组织内的个体细胞间的差异，不断揭示肿瘤发展过程中的基因变异及其变异率、追溯关键基因的克隆起源、肿瘤各亚型之间的基因序列差异、不同级别或不同类别的肿瘤细胞之间的差异、某种基因在不同肿瘤中的不同地位、对表观遗传学的影响以及长期难以攻破的肿瘤异质性和出现药物抗性等问题。随着测序技术的不断发展，测序技术成本的降低，测序人群数量的不断上升，我们可逐步从“单个细胞”全面认识肿瘤“整体”，以完善肿瘤诊疗体系，进而从个体水平实现有效的靶向治疗。

［1］ Lipinski KA，Barber LJ，Davies MN，et al.Cancer evolution and the limits of predictability in precision cancer medicine［J］.Trends Cancer，2016，2（1）：49-63.

［2］ Eberwine J，Sul JY，Bartfai T，et al.The promise of single-cell sequencing［J］.Nat Methods，2014，11 （1）：25-27.

［3］ Zong C，Lu S，Chapman AR，et al.Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell［J］.Science，2012，338 （6114）：1622-1626.

［4］ Tang F，Barbacioru C，Wang Y，et al.mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell［J］.Nat Methods，2009，6（5）：377-382.

［5］ NavinN，Kendall J，Troge J，et al.Tumour evolution inferred by single-cell sequencing［J］.Nature，2011，472（7341）：90-94.

［6］ Ni X，Zhuo M，Su Z，et al.Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients［J］.Proc Natl AcadSci USA，2013，110（52）：21083-21088.

［7］ Zhang X，Marjani SL，Hu Z，et al.Single-cell sequencing for precise cancer research：progress and prospects［J］.Cancer Res，2016，76（6）：1305-1312.

［8］ Guo H，Zhu P，Guo F，et al.Profiling DNA methylome landscapes of mammalian cells with single-cell reduced-representation bisulfite sequencing［J］.Nat Protoc，2015，10（5）：645-659.

［9］ Buenrostro JD，Wu B，Litzenburger UM，et al.Singlecell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation［J］.Nature，2015，523（7561）：486-490.

［10］ Shapiro E，Biezuner T，Linnarsson S.Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize wholeorganism science［J］.Nat Rev Genet，2013，14（9）：618-630.

［11］ Sethsmith HM，Harris SR，Scott P，et al.Generating whole bacterial genome sequences of low-abundance species from complex samples with IMS-MDA［J］. Nat Protoc，2013，8（12）：2404-2412.

［12］ Galler K，Bräutigam K，Große C，et al.Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis［J］.Analyst，2014，139（6）：1237-1273.

［13］ Bose S，Wan Z，Carr A，et al.Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing［J］.Genome Biol，2015，16：120.

［14］ Yong W，Navin NE.Advances and applications of single-cell sequencing technologies［J］.Mol Cell，2015，58（4）：598-609.

［15］ Huang L，Ma F，Chapman A，et al.Single-cell wholegenome amplification and sequencing：methodology and applications［J］.Annu Rev Genomics Hum Genet，2015，16：79-102.

［16］ Hou Y，Song L，Zhu P，et al.Single-cell exome sequencing and monoclonal evolution of a JAK2-Negative myeloproliferative neoplasm［J］.Cell，2012，148 （5）：873-885.

［17］ Xu X，Hou Y，Yin X，et al.Single-cell exome sequencing reveals single-nucleotide mutation characteristics of a kidney tumor［J］.Cell，2012，148（5）：886-895.

［18］ Yu C，Yu J，Yao X，et al.Discovery of biclonal origin and a novel oncogene SLC12A5 in colon cancer by single-cell sequencing［J］.Cell Res，2014，24（6）：701-712.

［19］ Chen M，Song P，Zou D，et al.Comparison of multiple displacement amplification（MDA）and multiple annealing and looping-based amplification cycles （MALBAC）in single-cell sequencing［J］.PloS One，2014，9（12）：e114520.

［20］ Lovett M.The applications of single-cell genomics ［J］.Hum Mol Genet，2013，22（1）：22-26.

［21］ Macaulay IC，Voet T.Single Cell genomics：advances and future perspectives［J］.PLoS Genet，2014，10 （1）：e1004126.

［22］ Kolodziejczyk A，Kim JK，Svensson V，et al.The technology and biology of single-cell RNA sequencing ［J］.Mol Cell，2015，58（4）：610-620.

［23］ Olson ND，Lund SP，Colman RE，et al.Best practices for evaluating single nucleotide variant calling methods for microbial genomics［J］.Front Genet，2015，6：235.

［24］ Shirai M，Taniguchi T，Kambara H.Emerging applications of single-cell diagnostics［J］.Top CurrChem，2014，336：99-116.

［25］ Wang K，Kan J，Yuen ST，et al.Exome sequencing identifies frequent mutation of ARID1A in molecular subtypes of gastric cancer［J］.Nat Genet，2011，43 （12）：1219-1223.

［26］ Steinert G，Schölch S，Niemietz T，et al.Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer［J］.Cancer Res，2014，74 （6）：1694-1704.

［27］ Gao F，Ji G，Gao Z，et al.Direct ChIP-bisulfite sequencing reveals a role of H3K27me3 mediating aberrant hypermethylation of promoter CpG islands in cancer cells［J］.Genomics，2014，103（2-3）：204-210.

［28］ Wasserkort R，Kalmar A，Valcz G，et al.Aberrant septin 9 DNA methylation in colorectal cancer is restricted to a single CpG island［J］.BMC Cancer，2013，13（1）：1-11.

［29］ Newburger DE，Kashefhaghighi D，Weng Z，et al. Genome evolution during progression to breast cancer ［J］.Genome Res，2013，23（7）：1097-1108.

［30］ Kim KI，Simon R.Using single cell sequencing data to model the evolutionary history of a tumor［J］.BMC Bioinformatics，2014，15（1）：1-13.

［31］ Mäbert K，Cojoc M，Peitzsch C，et al.Cancer biomarker discovery：current status and future perspectives［J］.Int J RadiatBiol，2014，90（8）：659-677.

［32］ Normanno N，Rachiglio AM，Roma C，et al.Molecular diagnostics and personalized medicine in oncology：challenges and opportunities［J］.J Cell Biochem，2013，114（3）：514-524.

［33］ Murphy PJ，Cipriany BR，Wallin CB，et al.Singlemolecule analysis of combinatorial epigenomic states in normal and tumor cells［J］.Proc Natl AcadSci USA，2013，110（19）：7772-7777.

［34］ Prahallad A，Sun C，Huang S，et al.Unresponsiveness of colon cancer to BRAF（V600E）inhibition through feedback activation of EGFR［J］.Nature，2012，483（7387）：100-103.

［35］ Wang Y，Waters J，Leung ML，et al.Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing［J］.Nature，2014，512（7513）：155-160.

［36］ Massagué J，Obenauf AC.Metastatic colonization by circulating tumour cells［J］.Nature，2016，529（7586）：298-306.

［37］ Morimoto A，Mogami T，Watanabe M，et al.Highdensity dielectrophoretic microwell array for detection，capture，and single-cell analysis of rare tumor cells in peripheral blood［J］.PloS One，2014，10（6）：e0130418.

［38］ Ramsköld D，Luo S，Wang YC，et al.Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells［J］.Nat Biotechnol，2012，30（8）：777-782.

［39］ Heitzer E，Auer M，Gasch C，et al.Complex tumor genomes inferred from single circulating tumor cells by array-CGH and next-generation sequencing［J］.Cancer Res，2013，73（10）：2965-2975.

Single-cell sequencing technology and its application in cancer research and clinical diagnosis

ZHOU Ying1，HUANG Huayi1，2★
（1.Department of Laboratory Medicine，The People's Hospital of Guangxi Autonomous Region，Nanning，Guangxi Autonomous Region，China，530021；2.Department of Surgical Oncology，Roswell Park Cancer Institute，Buffalo，New York，USA，14263）

The heterogeneity of tumors is an important feature of cancer.Tumor cells that lack homogeneity increase the difficulty of targeting therapeutics.Therefore,identifying tumor heterogeneity is an important task.The single-cell sequencing(SCS)technology utilizes next generation sequencing methodology to examine the genomic sequence of a single cell,and obtain the variability of genetic and protein information among tumor cells,allowing for a better understanding of the cellular function and the surrounding microenvironment.By sequencing the whole genome,transcriptome,and epigenetic genes of a single cell,the complex mechanisms of heterogeneity in tumors can be uncovered,thus improving cancer diagnosis and prognosis prediction,as well as monitoring of therapeutic response.Here,we have summarized the advancement of SCS technology,the principle and procedures of its analysis,the shortcomings of the technology,and its usage in cancer research and potential application value in clinical diagnosis.

Single-cell sequencing；Next generation sequencing；Genome；Tumor；Heterogeneity

1.广西壮族自治区人民医院检验科，广西，南宁530021

2.美国罗斯威尔帕克癌症研究所肿瘤外科，美国，纽约，布法罗14263

★通讯作者：黄华艺，E-mail：Huayi.Huang@Roswellpark.org