山西产苦参花中生物碱类和黄酮类成分的分析与评价

张黄琴+朱振华+钱大玮+翁泽斌+郭盛+段金廒+雷振宏+李安平

[摘要] 该研究以苦参花资源化利用为目的，分析苦参花不同物候期中生物碱类、黄酮类资源性化学成分的含量，以期发现苦参花资源的潜在利用价值。采用UPLC-TQ-MS联用技术，对山西长治产苦参花中7个生物碱类及7个黄酮类成分进行分析测定。结果显示不同花期中都含有金雀花碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、N-甲基金雀花碱、苦参碱、槐果碱7种生物碱，各碱总和为花蕾1.47%、半开花1.34%、盛开花1.17%、败花1.01%，其中主要生物碱为N-甲基金雀花碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱，约占总生物碱量的83%；所测定的芦丁、木犀草素、槲皮素、异槲皮苷、三叶豆紫檀苷、苦参酮、苦参醇7种黄酮类成分，各黄酮总和花蕾495.2 μg·g^-1、半开花313.7 μg·g^-1、败花224.2 μg·g^-1、盛开花193.0 μg·g^-1，其中木犀草素的含量相对较高，约占所测总黄酮量的89%～94%。结果提示苦参花所含的喹诺里西啶类生物碱是其主要的资源性化学成分，可加以开发利用。

[关键词] 苦参花；花期；生物碱；黄酮；资源化利用

[Abstract] This study intends to explore the potential resource-orientedutilization value of the flower of Sophora flavescents by analyzing alkaloids and flavonoids in the flower of S. flavescens from Shanxi province. This study established a rapid UPLC-TQ-MS/MS method that is used for determination of seven alkaloids and seven flavonoids in the flower of S.flavescens. The different florescences all have the seven detected alkaloids such as cytisine，oxy-matrine，oxy-sophocarpine，sophoridine，N-methylcytisine，matrine，sophocarpine.The total contents of detected alkaloids are as follows： flower buds 1.47%，primal flowers 1.34%，full bloomed flowers 1.17%，faded flowers 1.01%. The top three contents of alkaloids are N-methylcytisine ，oxy-sophocarpine and oxymatrine，accounting for about 83% of the total amount of detected alkaloids. All the samples in different florescences have the seven detected flavonoids such as rutin，luteolin，quercetin，isoquercitrin，trifolirhizin，kurarinone，and kushenol I. The total contents of detected alkaloids are as follows： flower buds 495.2 μg·g^-1 ，primal flowers 313.7 μg·g^-1 ，faded flowers 224.2 μg·g^-1，full bloomed flowers 193.0 μg·g^-1. The content of luteolinis relatively higher than other detected flavonoids，accounting for about 89%-94% of the total amount of detected flavonoids. The results indicated that the flower of S.flavescens could be an important material resource to obtain the resourceful alkaloids. This result can provide scientific basis for resource-oriented utilization and industrial development of the flower of S. flavescens.

[Key words] flower of Sophora flavescens；florescences；alkaloids；flavonoids；resources utilization

doi：10.4268/cjcmm20162422

豆科槐屬植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根是一个常用大宗药材，其始载于《神农本草经》称其为水槐，列为中品。其味苦，性寒，具有清热燥湿，杀虫利尿等功效[1]。现代研究表明苦参药材的功效可能主要与其所含的生物碱类和黄酮类成分有关[2-5]，在临床治疗疾病方面具有重要的应用价值。目前我国苦参药材除野生资源外，在我国山西、陕西和辽宁等地已建立苦参栽培基地并大面积种植栽培苦参[6]。苦参为多年生植物，地上部分每年秋季枯萎，来年春天重新发芽，于栽种第3年秋天采收药材，栽种前两年一般不开花结籽，但第3年6—8月份却大量开花结籽。就全国而言每年有大量的花作为农业废弃物未被开发和利用而废弃。因此从资源循环利用的角度出发，探讨苦参植株非药用部位花可利用的价值显得尤为重要[7-8]。本文即选取采自山西长治苦参GAP种植基地的苦参花为研究对象，采用UPLC-TQ-MS技术对不同花期苦参花中生物碱类、黄酮类资源性成分进行分析，以探讨苦参花的开发利用价值和资源化利用策略，为苦参非药用部位的资源化利用提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

ACQUITY UPLC系统（二元高压泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器，Waters公司）；Xevo TQ/MS质谱系统（Waters公司）；MassLynx^TM质谱工作站（Waters公司）；ML204，MS105电子分析天平（梅特勒-托尼多仪器有限公司）；Millipore Q纯水系统（美国Millipore公司）；KQ-250E型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；Anke GL-16GⅡ型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试药与试剂

金雀花碱（cytisine）、氧化苦参碱（oxy-matrine）、氧化槐果碱（oxy-sophocarpine）、槐定碱（sophoridine）、N-甲基金雀花碱（N-methylcytisine）、苦参碱（matrine）、槐果碱（sophocarpine）、芦丁（rutin）、木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）、异槲皮苷（isoquercitrin）、三叶豆紫檀苷（trifolirhizin）、苦参酮（kurarinone）、苦参醇（kushenol I）均购自合肥博美生物科技有限公司（供含量测定用），经HPLC检测纯度均大于98%。甲酸、乙腈（Merck），甲醇（Tedia），乙酸铵、氨水、乙醇（分析纯，南京化学试剂股份有限公司）。

1.3 样品

本研究选择山西长治苦参GAP种植基地的苦参花为研究对象。根据花期分为花蕾、半开花、盛开花、败花，经晾晒干燥，其中S1～S3为花蕾，S4～S6为半开花，S7～S9为盛开花，S10～S12为败花。凭证标本存放于南京中医药大学江苏省中药资源产业化过程协同创新中心。

2 方法与结果

2.1 生物碱类成分分析

2.1.1 对照品溶液的制备

分别取金雀花碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱、N-甲基金雀花碱、苦参碱、槐果碱对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并定容配制成对照品储备液；取适量各成分储备液，加甲醇稀释定容，配制成混合对照品溶液，其中各成分质量分数分别为137.0，96.50，105.0，109.0，118.0，155.0，114.0 mg·L^-1。取上述混合对照品溶液用甲醇稀释成不同浓度的混标工作液。

2.1.2 供试品溶液的制备

取0.5 g样品粉末（40目），精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入75%乙醇50 mL，称重，静置1 h，超声1 h，冷却至室温，称重，以75%乙醇补足失重，摇匀，13 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，以0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.3 UPLC-TQ-MS分析条件

色谱分析条件Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）色谱柱；柱温35 ℃。流动相10 mmol·L^-1乙酸铵溶液（氨水调pH为8）（A），乙腈（B），梯度洗脱（0～4 min，95%～90% A；4～5 min，90%～80% A；5～9 min，80%～80% A；9～10 min，80%～75% A；10～13 min，75%～40% A；13～14 min，40%～5% A）。流速0.4 mL·min^-1；進样量 2 μL。

质谱检测条件ESI源；扫描方式ESI⁺模式；多反应检测（MRM）；毛细管电压3.0 kV；锥孔电压30 V；萃取电压3.0 V；离子源温度150 ℃；脱溶剂气温度：500 ℃；锥孔气流量50 L·h^-1；脱溶剂气流量1 000 L·h^-1，辅助气流0.15 mL·min^-1。各生物碱类成分的质谱参数见表1，色谱图见图1。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 标准曲线与定量限 精密量取2.1.1项下混标工作液按2.1.3项下的分析条件进行测定。以被测化合物的峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，并按信噪比（S/N）为10和3分别计算被测组分的定量限（LOQ）和检测限（LOD）。结果见表2，各成分线性良好，r均在0.982 7以上。

2.1.4.2 精密度试验 取中等浓度混合对照品溶液，在上述色谱条件下分别于1日内重复进样6次和连续3 d内重复进样3次以测定所分析的化学成分的峰面积，以各指标成分含量的（RSD）来评价日内及日间精密度。结果见表3，各成分日内精密度RSD≤2.1%，日间精密度RSD≤2.5%。

2.1.4.3 重复性试验 取S1号样品6份，按照2.1.2项下方法制备供试品溶液，分别进样分析，以样品中各指标成分含量的RSD值评价其重复性，结果见表3，重复性RSD≤2.7%。

2.1.4.4 稳定性试验 取S1号样品6份，按照2.1.2项下方法制备供试品溶液，置于4 ℃保存，分别于0，2，4，8，12，24 h进样分析，以各指标成分含量，计算RSD，考察方法的稳定性，结果见表3，稳定性RSD≤3.3%。

2.1.4.5 加样回收率试验 取0.25 g已知含量的样品9份（S1），加入样品中各成分80%，100%，120%的对照品，各平行3份，按照供试品溶液的制备方法处理并按上述条件测定，计算平均回收率和RSD，结果见表3，平均加样回收率95.34%～104.4%，RSD≤4.1%均符合分析要求。

2.1.5 含量测定

各样品按2.1.2项下的方法制得供试品溶液。取各供试品溶液，按2.1.3项下的条件进样测定，测定结果见表4。

2.2 黄酮类成分分析

2.2.1 对照品溶液的制备

分别取芦丁、木犀草素、槲皮素、异槲皮苷、三叶豆紫檀苷、苦参酮、苦参醇对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并定容配制成对照品储备液；取适量各成分储备液，加甲醇稀释定容，配制成混合对照品溶液，其中各成分质量分数分别为151.0，120.0，129.0，120.0，125.0，113.0，126.0 mg·L^-1。取上述混合对照品溶液用甲醇稀释成不同浓度的混标工作液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取1 g样品粉末（40目），精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入80%乙醇20 mL，称重，静置1 h，超声1 h，冷却至室温后称重，加80%乙醇补足失重，摇匀，13 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，以0.22 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 UPLC-TQ-MS分析条件

色谱分析条件Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱；柱温35 ℃。流动相0.1%甲酸水（A），乙腈（B），梯度洗脱（0～1.5 min，95%～80% A；1.5～6 min，80%～70% A；6～7 min，70%～5% A；7～8 min，5%～5% A；8～9 min，5%～95% A）。流速：0.4 mL·min^-1；进样量 2 μL。

质谱检测条件ESI源；扫描方式ESI⁺，ESI^-模式；多反应检测（MRM）；毛细管电压3.0 kV；锥孔电压43 V；萃取电压3.0 V；离子源温度150 ℃；脱溶剂气温度400 ℃；锥孔气流量 50 L·h^-1；脱溶剂气流量1 000 L·h^-1，辅助气流：0.15 mL·min^-1。各黄酮类成分的质谱参数见表5，色谱图见图2。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 标准曲线与定量限 精密量取2.2.1项下混标工作液按2.2.3项下的分析条件进行测定。以被测化合物的峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，并按信噪比（S/N）为10和3分别计算被测组分的定量限（LOQ）和检测限（LOD），结果见表6，各成分线性良好，r值均在0.996 2以上。

2.2.4.2 精密度试验 取中等浓度混合对照品溶液，在上述色谱条件下分别于1日内重复进样6次和连续3 d内重复进样3次以测定所分析的化学成分的峰面积，以各指标成分含量的（RSD）来评价日内及日间精密度，结果见表7，各成分日内精密度RSD≤2.7%，日间精密度RSD≤2.9%。

2.2.4.3 重复性试验 取S1号样品6份，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样分析，以样品中各指标成分含量的 RSD评价其稳定性，结果见表7，重复性RSD≤3.1%。

2.2.4.4 稳定性试验 取S1号样品6份，按照2.2.2項下方法制备供试品溶液，置于4 ℃保存，分别于0，2，4，8，12，24 h分别取样，进行UPLC-TQ-MS分析，以各指标成分含量，计算RSD，考察方法的稳定性。

2.2.4.5 加样回收率试验 取0.5 g已知含量的样品9份（S1），加入样品中各成分80%，100%，120%的对照品，各平行3份，按照供试品溶液的制备方法处理并按上述条件测定，计算平均回收率和RSD，结果见表7，平均加样回收率95.21%～106.0%，RSD≤4.0%均符合分析要求。

2.2.5 含量测定

各样品按2.2.2项下的方法制得供试品溶液。取各供试品溶液，按2.2.3项下的条件进样测定，测定结果见表8。

3 讨论

3.1 苦参花的适宜采收期

不同花期的苦参花中生物碱、黄酮的种类大致相同，但含量有差异。各花期平均总生物碱为花蕾>半开花>盛开花>败花，所测总黄酮含量花蕾>半开花>败花>盛开花。经ANOVA分析，花蕾中的各生物碱类、黄酮类成分含量与其他花期含量均有统计学差异。提示苦参花的最佳采收期为花蕾期。

3.2 苦参花的利用前景探讨

药典规定，苦参药材所含生物碱以苦参碱和氧化苦参碱为主，总量不得少于1.0%[1]。与药用部位的主要生物碱种类不同，苦参花中主要生物碱为N-甲基金雀花碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱，总量达0.8%以上，其中花蕾中高达1.2%；所测生物碱中N-甲基金雀花碱含量最高达0.3%以上，尤其是花蕾中高达0.6%以上，提示苦参花可作为N-甲基金雀花碱的原料。

本研究表明苦参花中所测定的7种生物碱总量达1%以上，其中以花蕾中N-甲基金雀花碱含量最高，达0.6%以上。可将苦参花作为获取生物碱类（尤其是N-甲基金雀花碱）资源性化学成分的补充资源，对其进行资源化利用与产业化开发，提升苦参资源的利用效率。苦参的生物碱类化学成分具有较好的杀虫、抑菌活性[9-12]，近年来在兽药领域广泛应用，目前的研究着重于苦参碱及氧化苦参碱，但N-甲基金雀花碱的研究较少，其功效的开发还有待进一步研究以挖掘苦参花的潜在利用价值。

文献报道苦参药材中含有丰富的异戊烯基黄酮类成分[13]，但研究表明，苦参花中这些成分相对较少，但含有较多的木犀草素，其合成途径有待进一步探讨。文献报道槐属植物的花，如槐花中含有大量的芦丁等黄酮[14]，但本研究结果表明苦参花中的芦丁含量较少。结合黄酮类成分的分析，提示苦参花不是获取黄酮的好原料。

[参考文献]

[1] 中国药典.一部[S]. 2015： 202.

[2] 赵琴琴，张玉峰，范骁辉. 高效液相色谱多级质谱联用法同时鉴定苦参中的两大类活性成分[J]. 中国中药杂志，2011，36（6）：762.

[3] 张翅，马悦，高慧敏，等. 苦参化学成分研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志，2014，20（4）：205.

[4] 陈静，梁生旺. 苦参的成分及质量分析研究进展[J]. 广东药学院学报，2012，28（5）：569.

[5] Xi C，Yi C，Yang X，et al. Liquid chromatography of active principles in Sophora flavescens root[J].Chromatogra B Analyti Technol Biomedi Life Sci，2004，812（1/2）：149.

[6] 李安平. 中国苦参[M]. 北京：中国医药科技出版社，2014.

[7] 段金廒. 中药废弃物的资源化利用 [M]. 北京： 化学工业出版社，2013.

[8] 段金廒. 中药资源化学：理论基础与资源循环利用 [M]. 北京：科学出版社，2015.

[9] 郑永权，姚建仁，邵向东，等. 苦参杀虫抑菌活性成分研究[J]. 农药学学报，1999（3）：91.

[10] 王海. 苦参总碱的抗菌性能和抗菌机理及其在高吸水树脂上的应用[D]. 泉州： 华侨大学，2014.

[11] 朱晓伟，宝金荣，布仁. 苦参碱和氧化苦参碱抗肿瘤作用研究进展[J]. 中草药，2009（s1）：82.

[12] 穆甲骏，王卫国，侯启昌. 苦参生理活性物质研究现状与展望[J]. 河南师范大学学报：自然科学版，2014（6）：131.

[13] 李巍，梁鸿，尹婷，等. 中药苦参主要黄酮类成分的研究[J]. 药学学报，2008，43（8）：833.

[14] 马鸿雁，周婉珊，褚夫江，等. 苦参中黄酮类成分的高效液相指纹图谱及5种成分的含量测定[J]. 中国中药杂志，2013，38（16）：2690.

[15] 劉元昀，刘会敏，王憬，等. 槐米中主要黄酮苷元成分的分析[J]. 河北师范大学学报：自然科学版，2015（3）：252.

[责任编辑 丁广治]