针刺对血管性痴呆大鼠前额叶皮层氧化应激及神经元损伤的影响

杜斯琪，王雪蕊，朱雯，姬彩硕，李天然，肖凌勇，刘存志



针刺对血管性痴呆大鼠前额叶皮层氧化应激及神经元损伤的影响

杜斯琪，王雪蕊，朱雯，姬彩硕，李天然，肖凌勇，刘存志

首都医科大学附属北京中医医院，针灸神经调控北京市重点实验室，北京 100010

目的 观察针刺对慢性脑低灌注大鼠前额叶皮层氧化应激及神经元损伤的影响，探讨针刺改善血管性痴呆（VD）大鼠认知损害的分子机制。方法 采用永久性双侧颈动脉结扎法造成大鼠慢性脑低灌注复制VD模型，造模后大鼠随机分为模型组、针刺组和非穴组，同时设假手术组作为对照。针刺组和非穴组造模后3 d针刺治疗，2周后灌注取材。尼氏染色检测前额叶皮层神经元数量，DHE染色检测活性氧（ROS）含量，黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果 模型组神经元数量、SOD活性较假手术组降低，ROS含量升高；针刺组神经元数量和SOD活性较模型组明显升高、ROS含量降低，同时非穴组各指标未见明显改善。结论 针刺可抑制VD大鼠前额叶皮层的氧化应激水平，改善神经元损伤和丢失。

针刺；血管性痴呆；氧化应激；神经元损伤；活性氧；超氧化物歧化酶；大鼠

血管性痴呆（VD）是常见呆病，表现为脑血流减少，认知功能进行性下降。临床上对VD尚无明确的诊断和治疗标准[1]。有研究显示，永久性双侧颈动脉结扎（2VO）造成的大鼠慢性脑低灌注是最常用的VD模型[2]。造模后皮层神经元损伤和丢失、白质损伤等病理改变均与认知功能损害密切相关[3]。本课题组前期研究表明，针刺能明显改善VD大鼠学习记忆[4-5]。本研究采用2VO模型，观察针刺对VD大鼠前额叶皮层氧化应激水平的影响，探讨其相关机制。

1 材料与方法

1.1 动物

10周龄SPF级雄性大鼠48只，体质量300～320 g，北京市维通利华技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于中国中医科学院基础理论研究所SPF级动物实验室。

1.2 主要试剂与仪器

焦油紫染色液（上海碧云天生物技术公司），活性氧（ROS）试剂盒（美国GENMED公司），超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。冰冻切片机（德国Leica公司），DHG-9023A烤箱（上海林频仪器有限公司），光学显微镜（日本Olympus），一次性无菌针灸针（华佗牌，0.25 mm×13 mm）。

1.3 造模与分组

采用2VO大鼠复制VD模型[6]，另随机取12只大鼠作为假手术组，假手术组手术过程与造模一致，但双侧颈总动脉不结扎。造模成功大鼠随机分为模型组、针刺组和非穴组，每组12只。

1.4 干预

针刺组和非穴组于造模后3 d针刺治疗，其中针刺组选取“百会”和双侧“足三里”捻转补法各30 s，之后不留针，取穴位置参照文献[7]，非穴组参照文献[8-9]取常用非穴点（双胁肋下髂棘直上10 mm）行无行针手法的浅刺不留针。以上治疗每日1次，连续6 d休息1 d，共12次。另外假手术组、模型组和非穴组进行与针刺组相同时间和手法的捉抓刺激。

1.5 取材及处理

末次针刺后第2日，大鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥钠（0.2 mL/100 g）麻醉，每组取5只大鼠4%多聚甲醛固定，并取出全脑，蔗糖梯度脱水后冰冻切片（厚度10 μm）；剩余大鼠直接断头后分离前额叶皮层，-80 ℃冰箱保存。

1.6 神经元损伤检测

将切片置于50 ℃焦油紫染色液中孵育45 min，用蒸馏水冲洗除去浮色，再用乙醇梯度脱水、二甲苯透明，最后用中性树脂及盖玻片封片，镜下观察皮层神经元改变。

1.7 活性氧含量测定

室温下将切片滴加DHE试剂避光孵育30 min，封片后用荧光显微镜观察，其中激发波长为540 nm，发射波长为590 nm。

1.8 超氧化物歧化酶活性测定

采用黄嘌呤氧化酶法测定，按照SOD试剂盒说明书操作，用分光光度仪测定。

1.9 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以±表示，采用方差分析。＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 针刺对大鼠前额叶皮层神经元的影响

与假手术组比较，模型组皮层神经元数量显著减少，且细胞形态固缩或不规则；针刺组神经元数量增加（＜0.05），且形态固缩的神经元减少；而非穴组与模型组比较无明显差异。结果见图1、图2。

假手术组模型组 针刺组非穴组

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05（下同）

2.2 针刺对大鼠前额叶皮层活性氧含量的影响

镜下DHE染色的目的荧光呈红色，假手术组未见明显阳性染色。模型组较假手术组ROS含量明显升高（＜0.05），针刺组较模型组ROS含量明显降低（＜0.05）。结果见图3、图4。

假手术组模型组 针刺组非穴组

2.3 针刺对大鼠前额叶皮层超氧化物歧化酶活性的影响

与假手术组比较，模型组皮层SOD活性明显下降（＜0.05）；与模型组比较，针刺组SOD活性显著升高（＜0.05），非穴组未见明显差异。结果见图5。

3 讨论

VD属中医学“呆症”范畴，其病位在脑。临床上针刺治疗痴呆多采用远近配穴，头部最常取的穴位是百会，肢体穴位最常用足三里，其中百会内入络脑，足三里助化生气血以濡养脑髓，两穴相配能够益肾健脑调神。另外，非穴组取文献中常用的非经非穴点，以凸显针刺的特异性效应[8-9]。本课题组既往研究发现，针刺“足三里”和“百会”能明显改善慢性脑低灌注引起的大鼠学习记忆损害，而非穴治疗并无改善作用[4]。2VO造成的慢性脑低灌注可引起全脑慢性、广泛性的缺血状态，能很好地复制VD的病理生理过程。采用双血管阻断复制VD模型发现，脑缺血可导致海马和皮层的神经元死亡、白质损伤、胶质细胞激活和学习记忆损害，对揭示VD的发病机制至关重要。本实验采用尼氏染色、免疫荧光等方法，发现造模后1周，皮层神经元数量随缺血时间的延长而进行性减少，而神经元缺失在缺血早期以神经元坏死为主，慢性期以凋亡为主[10]。本研究发现，针刺能显著减少2VO引起的大鼠前额叶皮层神经元数量减少，改善神经元形态。

脑缺血导致氧化应激是神经元损伤与丢失的主要机制。研究表明，颈总动脉结扎后大鼠脑组织ROS等自由基水平明显升高[11]，导致蛋白、脂质和DNA的氧化性损伤，从而引发组织细胞损伤。另外，脑缺血也会影响神经元内的抗氧化系统。SOD是组织细胞主要的氧化还原调节酶，能催化生物体内超氧自由基的清除反应。有研究发现，VD大鼠海马SOD活性较正常大鼠下降[3]，表明SOD活性降低可能是引起VD的重要机制。本研究发现，针刺能抑制慢性低灌注引起的大鼠前额叶皮层ROS含量增加SOD活性升高。

综上，本研究发现针刺“足三里”“百会”可改善慢性脑低灌注引起的大鼠前额叶皮层神经元损伤，抑制氧化应激，这可能是其治疗VD的机制之一。

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Effects of Acupuncture on Oxidative Stress and Neuronal Damage in Prefrontal Cortex of Vascular Dementia Rats

DU Si-qi, WANG Xue-rui, ZHU Wen, JI Cai-shuo, LI Tian-ran, XIAO Ling-yong, LIU Cun-zhi

Objective To observe the effects of acupuncture on oxidative stress and neuronal damage in the prefrontal cortex of chronic cerebral hypoperfusion (CCH) rats; To investigate the molecular mechanisms of acupuncture in cognitive impairment of vascular dementia (VD) rats. Methods The animal model of VD was replicated by permanent bilateral common carotid artery occlusion (2VO) to induce CCH in rats. After modeling, rats were randomized into model group, acupuncture group and non-acupoint group. Sham-operation group was set as control group. Rats of acupuncture group and non-acupoint group were treated with needling for 2 weeks at 3 days after 2VO. Nissl and DHE staining were respectively used to evaluate the numbers of neurons and ROS level. SOD activity was examined by xanthine oxidase technique. Results Compared with sham-operation group, the number of neurons and SOD activity decreased in the model group, while the ROS level increased. Compared with the model group, the number of neurons and SOD activity increased in the acupuncture group, while the ROS level decreased. There were no obvious changes in all indexes in non-acupoint group. Conclusion Acupuncture can inhibit oxidative stress and improve neuronal damage and loss in the prefrontal cortex of VD rats.

acupuncture; vascular dementia; oxidative stress; neuronal damage; SOD; ROS; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.013

R245

A

1005-5304(2017)06-0053-03

国家自然科学基金面上项目（81473501）

刘存志，E-mail：lcz623780@126.com

（2017-01-13）

（修回日期：2017-02-07；编辑：华强）