针康法对脑缺血大鼠神经功能和缺血半暗区皮层血管内皮生长因子受体表达的影响①

叶涛，唐 强，朱路文，陈慧杰，吴孝军，李宏玉，田 源

针康法对脑缺血大鼠神经功能和缺血半暗区皮层血管内皮生长因子受体表达的影响①

叶涛1，唐 强2，朱路文2，陈慧杰2，吴孝军1，李宏玉1，田 源1

目的观察针康法对脑缺血大鼠神经功能和缺血半暗区皮层血管内皮生长因子受体Flt-1、Flk-1蛋白表达的影响。方法90只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分入假手术组、模型组、针刺组、康复组和针康组，每组再分为术后3 d、7 d、14 d三个亚组(n=6)。模型组、针刺组、康复组和针康组用线栓法制备永久性局灶性脑缺血模型。假手术组和模型组不进行治疗，针刺组采用头穴丛刺针法治疗，康复组给予跑台训练，针康组采用头穴丛刺结合跑台训练治疗。术后各时间点，采用改良神经损害严重程度评分(mNSS)进行评定，Western blotting法检测缺血半暗区皮层Flt-1、Flk-1表达。结果与模型组比较，各治疗组术后各时间点mNSS评分降低(P＜0.05)；术后7 d、14 d，与针刺组、康复组比较，针康组评分进一步降低(P＜0.05)。与模型组比较，各治疗组术后各时间点Flt-1、Flk-1蛋白表达升高(P＜0.05)；与针刺组、康复组比较，针康组Flt-1、Flk-1蛋白表达水平进一步升高(P＜0.05)。结论针康法治疗可进一步改善脑缺血大鼠神经行为，可能与其持续促进缺血半暗区皮层Flt-1、Flk-1蛋白表达有关。

脑缺血；针康法；神经功能；血管内皮生长因子受体；Flt-1；Flk-1；大鼠

缺血性脑卒中约占全部脑卒中的70%，是由于栓塞、椎动脉和/或颈动脉闭塞或狭窄等因素造成脑部供血不足，引起脑组织缺血缺氧，导致局限性脑组织坏死的总称，发病率、致残率、致死率居高不下，并呈现年轻化趋势[1]。针康法已经广泛运用于脑卒中患者各类功能障碍的治疗，临床疗效显著，安全性和有效率得到大量临床与基础研究证实[2]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)/血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)是新生血管和侧支循环形成所必须的调节系统，VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1)表达的上调，可增强VEGF促血管新生、细胞分化与神经营养再生等效应[3-5]。本研究观察针康法对脑缺血大鼠神经功能及缺血半暗区皮层Flt-1和Flk-1蛋白表达的影响，探讨针康法神经保护作用的机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠，初始体质量(250±20)g，鼠龄10～12周，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供，合格证书编号SYXK(黑) 2010007。饲养条件：温度23～25℃，湿度55%～65%，12 h明暗交替。实验前所有大鼠经适应性喂养1周及跑台训练3 d(15 m/min，30 min/d)，筛选可完成跑台训练方案的大鼠90只。实验过程中大鼠的处置严格遵守动物伦理准则和指南的相关规定。

将90只大鼠编号，计算机生成含90个数的随机数字表，任意选择表中一个数为起始点对应大鼠编号1，从左至右，自上而下分别对应1～90号大鼠。用随机数字除以5得余数确定每只大鼠的分组，余数0、1、2、3、4分别对应假手术组、模型组、针刺组、康复组及针康组，各组均有18只大鼠；同法将18只大鼠再分入3 d、7 d、14 d三个亚组(n=6)。

造模失败或死亡大鼠另选大鼠补充。

1.2 实验试剂与仪器

Flt-1、Flk-1多克隆抗体：SANTA CRUZ公司。预染蛋白分子量标准：FERMENTAS公司。TEMED：AMRESCO公司。PVDF膜：MILLIPORE公司。羊抗兔IgG-HRP：BEYOTIME公司。β-actin抗体：WANLEIBIO公司。

ZH-PT型动物实验跑台：安徽正华生物仪器设备有限公司。Multiskan FC型酶标仪：THERMO公司。3K-18高速冷冻离心机：SIGMA公司。DYCZ-24DN型蛋白凝胶电泳仪、DYCZ-40D型转印电泳仪、DYY-7C型电泳仪电源、WD-9405B型脱色摇床：北京六一仪器厂。BIS910凝胶成像分析系统：北京东胜创新生物科技有限公司。微量移液器：THERMO公司。

1.3 模型制备

参考Longa法[6]及前期实验研究[7]制备永久性脑缺血大鼠模型。术前12 h禁食。10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。颈部备皮，碘伏消毒后颈正中切口，暴露大鼠右侧颈总、颈外及颈内动脉。结扎颈外、颈总动脉，用微动脉夹阻闭分叉处血流，在其下面3～5 mm处用2 ml注射器针头斜刺一个“V”形小口；将头端2 mm过蜡、长3 cm的鱼线送入血管，备活结以固定线栓；松开动脉夹，将鱼线送入颈内动脉，阻断大脑中动脉血流。将活结扎死以固定线栓。消毒，逐层缝合。

假手术组大鼠不插入线栓，其余操作相同。

术后1 d，采用Longa 5级4分制标准[6]筛选模型，1～3分大鼠纳入实验。

1.4 方法

假手术组及模型组术后回笼饲养，不进行任何治疗，只给予同等条件抓取。

针刺组于术后1 d，采用头穴丛刺针法治疗，每天1次。取百会穴及其左、右各旁开2 mm处，用直径0.25 mm、长25 mm针灸针进行丛刺，快速捻转1 min后留针2 h[7]。

康复组于术后1 d进行跑台训练，每次30 min，每天1次。坡度0°，速度：第1～3天8 m/min，第4～7天12 m/min，第7天后15 m/min[7]。

针康组于术后1 d行针康法治疗，每天1次。头穴丛刺针留针期间进行跑台训练，头穴丛刺方案与跑台训练方案同针刺组与康复组。

1.5 神经行为学评估

术后各时间点，大鼠干预结束后，采用改良神经损害严重程度评分(modified Neurologic Severity Score,mNSS)[8]评估大鼠神经功能恢复情况。见表1。

表1 mNSS评分标准

1.6 Western blotting

mNSS评分结束后，大鼠10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，冰板上快速断头取脑，剥离大脑中动脉梗死周边皮层缺血组织，液氮速冻5 min，-80℃冰箱保存备用。

取一定量标本，加入RIPA裂解液、PMSF制成蛋白匀浆，低温孵育5 min，12000 r/min、4℃离心10 min，取上清液。BCA法测定上清液中蛋白质总浓度，上样体积20 μl，含蛋白50 μg。10%SDS-PAGE电泳分离目的蛋白(80 V,2.5 h)，电转移到PVDF膜上(70 V,1.5 h)。TTBS缓冲液配制的5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h，将膜放入Flt-1(1∶200)、Flk-1(1∶200)一抗中，4℃过夜。加入已羊抗兔IgG-HRP(1∶5000)二抗，37℃孵育45 min，TBST洗膜，加入ECL发光孵育5 min，显影，凝胶成像仪照相记录，用Gel-Pro Analyzer 4.0对反应条带进行定量分析，计算相对灰度。

1.7 统计学分析

采用SPSS 22.0进行统计学处理，mNSS评分与Flt-1、Flk-1蛋白相对表达量均以(xˉ±s)表示，各时间点组间比较采用单因素方差分析，事后两两比较采用LSD t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 mNSS

各时间点，假手术组mNSS评分均为0；与假手术组比较，模型组评分升高(P＜0.05)；与模型组比较，针刺组、康复组、针康组评分均降低(P＜0.05)。术后7 d、14 d，与针刺组、康复组比较，针康组mNSS评分降低(P＜0.05)。见表2。

表2 各组各时间点mNSS评分比较

2.2 Flt-1

各时间点，假手术组Flt-1蛋白少量表达；模型组较假手术组Flt-1蛋白表达升高(P＜0.05)；与模型组比较，针刺组、康复组、针康组Flt-1蛋白表达升高(P＜0.05)；与针刺组、康复组比较，针康组Flt-1蛋白表达进一步升高(P＜0.05)。见表3、图1。

表3 各组各时间点Flt-1蛋白表达

图1 各组各时间点Flt-1蛋白表达

2.3 Flk-1

各时间点，假手术组Flk-1蛋白少量表达；模型组较假手术组Flk-1蛋白表达升高(P＜0.05)；与模型组比较，针刺组、康复组、针康组Flk-1蛋白表达升高(P＜0.05)；与针刺组、康复组比较，针康组Flk-1蛋白表达进一步升高(P＜0.05)。见表4、图2。

表4 各组各时间点Flk-1蛋白表达

3 讨论

针康法是基于脑卒中后各类功能障碍创立的针、康一体化治疗体系，是中医康复方法与现代康复技术有机融合，具有“针康同步、动态治疗、整体康复”治疗优势[2]。前期我们借助现代实验手段，在神经血管单元的框架内，从突触重塑、神经血管再生、细胞凋亡及内源性神经干细胞等角度阐释针康法干预效应的机理，取得一系列研究成果[2,9-16]，但针康法脑保护作用机制并不局限于此，仍有待进一步阐明。

mNSS从运动、感觉、平衡、反射缺损及异常活动四个方面评定神经功能。本研究显示，针康法可加速神经功能的恢复，优于单一头穴丛刺或康复治疗，且远期的神经功能预后更佳，充分体现两者有机结合的优势，与我们此前的研究一致。

图2 各组各时间点Flk-1蛋白表达

血管发生是指从原有的血管上生出新的毛细血管，是缺血后脑组织再次获得氧和营养的自然保护机制，可减轻缺血性脑损伤，促进神经功能恢复。VEGF作为机体内最重要的促血管生长因子，不仅可以促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性，诱导内皮细胞迁移和浸润，促进新生血管和侧支循环形成，还能直接作用于皮质、海马和小脑等各部位神经细胞，发挥神经营养再生、神经保护和细胞分化等功能[3,5,17-18]。研究证实[5,19-22]，VEGF通过与其主要受体Flt-1和Flk-1结合而发挥生物学效应。脑缺血后，因低氧、缺血刺激，VEGF/VEGFR系统被激活，诱导大量新生血管形成，促进侧支循环建立，使缺血脑组织得以重新灌注，改善组织缺氧与营养供应，从而减少神经元凋亡或死亡，降低脑损伤程度，促进神经功能的恢复。刘娟等[23]发现，补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血损伤的治疗作用与增强VEGF及Flk-1表达有关。

前期我们已经证实，针康法可以促进缺血半暗区VEGF蛋白表达，促进脑缺血后微血管再生[13]。本研究显示，脑缺血后，脑组织通过上调缺血半暗区Flt-1、Flk-1蛋白表达，参与调节VEGF介导的微血管重建、神经再生和神经元存活过程。虽然Flt-1、Flk-1蛋白表达在时间分布上高度一致，但Flk-1表达强度高于Flt-1，这可能与Flk-1是VEGF促内皮细胞有丝分化、血管新生等功能的主要调节者，而Flt-1侧重于损伤区微循环重建，促进病理性血管发生与管腔成形

过程有关[3,24-25]。针刺、康复治疗介入后，Flt-1、Flk-1表达明显上调，促进、维持VEGF促血管新生、神经元存活和神经营养再生过程[13-14]；而针康法治疗后，Flt-1、Flk-1蛋白表达水平始终高于单一针刺或康复治疗，且14 d时仍有较高表达。

综上所述，针康法治疗可进一步改善脑缺血大鼠神经行为，可能与其持续促进缺血半暗区皮层Flt-1、Flk-1蛋白表达，正向调控VEGF促血管新生、神经元存活和神经营养再生过程，促进缺血区微血管重建，加快神经功能恢复有关。

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Effects of Acupuncture-rehabilitation Therapy on Neurological Function and Expression of Vascular Endothelial Growth Factor Receptors,Flt-1 and Flk-1,after Focal Cerebral Ischemia in Rats

YE Tao1,TANG Qiang2,ZHU Lu-wen2,CHEN Hui-jie2,WU Xiao-jun1,LI Hong-yu1,TIAN Yuan1
1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150040,China;2.the Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150001,China

TANG Qiang.E-mail:tangqiang1963@163.com

Objective To explore the effect of acupuncture-rehabilitation therapy on neurological function and expression of Flt-1 and Flk-1,members of vascular endothelial growth factor receptors,after permanent focal cerebral ischemia in rats.Methods Ninety male Sprague-Dawley rats were divided into five groups,namely sham group,model group,acupuncture group,rehabilitation group and acupuncture-rehabilitation group,and each group was further divided into 3-day,7-day and 14-day subgroups,equally.Their middle cerebral arteries were occluded except those of sham group.The sham and model groups accepted no treatment,while the acupuncture group accepted cluster needling of scalp acupuncture,the rehabilitation group accepted treadmill training,and the acupuncture-rehabilitation group accepted both acupuncture and treadmill training.They were assessed with modified Neurologic Severity Score(mNSS)3,7 and 14 days after modeling,while the expression of Flt-1 and Flk-1 were determined with Western blotting.Results The mNSS score reduced in all the treatment groups(P＜0.05)compared with that of the model group at every time point,and was the least in the acupuncture-rehabilitation group(P＜0.05)7 and 14 days after modeling among the treatment groups.Meanwhile,the expression of Flt-1 and Flk-1 protein increased in all the treatment groups(P＜0.05),and was the most in the acupuncture-rehabilitation group(P＜0.05).Conclusion Acupuncture-rehabilitation therapy can promote the neurological function recovery in rat with permanent focal cerebral ischemia,which may be associated with the continuous inducement of Flt-1,Flk-1 protein expression in ischemic penumbra cortex.

cerebral ischemia;acupuncture-rehabilitation therapy;neurological function;vascular endothelial growth factor receptors; Flt-1;Flk-1;rats

R743.3

A

1006-9771(2017)05-0520-05

2017-01-25

2017-02-21)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.05.006

1.国家自然科学基金项目(No.81273818;No.81473762)；2.黑龙江中医药大学领军人才计划项目(No.2012RCL02)。

1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨市150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨市150001。作者简介：叶涛(1989-)，男，汉族，福建漳平市人，博士研究生，主要研究方向：脑卒中中医康复基础与临床研究。通讯作者：唐强(1963-)，男，汉族，四川大竹县人，博士，教授，主要研究方向：神经系统疾病中医康复基础与临床研究。E-mail:tangqiang1963@163.com。[本文著录格式]叶涛，唐强，朱路文，等.针康法对脑缺血大鼠神经功能和缺血半暗区皮层血管内皮生长因子受体表达的影响[J].中国康复理论与实践,2017,23(5):520-524.

CITED AS:Ye T,Tang Q,Zhu LW,et al.Effects of acupuncture-rehabilitation therapy on neurological function and expression of vascular endothelial growth factor receptors,Flt-1 and Flk-1,after focal cerebral ischemia in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017, 23(5):520-524.