两种不同慢传输便秘大鼠模型构建方法比较及对水通道蛋白的影响①

姬甜丽，钱海华

两种不同慢传输便秘大鼠模型构建方法比较及对水通道蛋白的影响①

姬甜丽，钱海华

目的比较进食含复方地芬诺酯的饲料和用复方地芬诺酯混悬液灌胃复制大鼠慢传输便秘(STC)模型的差异。方法40只Sprague-Dawley大鼠随机均分为灌胃对照(A)组、灌胃(B)组、饲喂对照(C)组、饲喂(D)组。B组采用复方地芬诺酯混悬液灌胃14 d，A组用等量生理盐水灌胃，D组进食含有复方地芬诺酯的饲料120 d，C组进食普通饲料。造模成功后炭墨灌胃，观察各组肠道炭墨推进率；免疫组织化学方法检测水通道蛋白(AQP)3、AQP4蛋白含量。结果A、B组各有2只大鼠死亡。肠道炭墨推进率D组低于B组(P＜0.05)；AQP3、AQP4蛋白水平D组均高于B组(P＜0.05)。结论进食复方地芬诺酯饲料120 d较复方地芬诺酯灌胃14 d能够更安全、稳定地复制STC模型。AQP可能参与STC的发生、发展。

慢传输便秘；模型；水通道蛋白；大鼠

在慢传输便秘(slow transit constipation,STC)模型复制中，复方地芬诺酯灌胃是一种常用方式，具有耗时短、定量较精确的优点。但注射器灌胃给药，动物感染率较高，注射剂的制作对实验室的要求也较高[1]；灌胃操作增加实验人员被咬伤、挠伤的概率；同时操作不当极易导致动物误吸窒息，从而增加动物的死亡率。长期进食含有复方地芬诺酯饲料的造模方式可明显减少以上弊端。研究证明[2]，长期进食复方地芬诺酯可明显降低结肠动力，减少肠道蠕动，减慢肠道传输速度，从而形成便秘，且未产生组织学损害，比较接近STC的结肠功能状态。

自第一个水通道蛋白(aquaporin,AQP)于1988年被Agre等发现[3]，关于AQP与体液转运之间关系的研究愈来愈多[4-8]。AQP在人体组织细胞中分布十分广泛，是生物膜上的一种通道蛋白，通过调节生物膜的透水性，介导水的跨膜转运。

STC是一种病因不明、病程冗长、病情顽固的疾病，是多种疾病[9-10](肛裂、痔疮、直肠脱垂、睡眠障碍、焦虑抑郁、老年性痴呆等)的诱发因素，甚至可以诱发心脑血管疾病，直接威胁生命[11]。AQP与STC关系密切。AQP3与结肠水液代谢有密切联系[8,12-13]，AQP4与便秘的关系不甚明确[14]。Ma等[15]和Wang等[16]剔除小鼠结肠AQP4基因，发现小鼠结肠对水吸收功能下降，大便中水分明显增多，证明AQP4在结肠的表达与结肠水分吸收有关。也有文献报道[17]，AQP4在STC患者结肠中表达很少，推测AQP4对水的重吸收未起到重要作用，对STC的发生、发展影响不大。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康普通级Sprague-Dawley大鼠40只，雌、雄各半，体质量(170±10)g。按完全随机分组方法[18]，将大鼠分为灌胃对照组(A组)、灌胃模型组(B组)、饲喂对照组(C组)、饲喂模型组(D组)。雌、雄性大鼠分别编号1～20，从随机数表按一定顺序抄录20个数字，分别除以4，余数1、2、3、0分别分入A、B、C、D组。如果组间大鼠数不等，则从鼠数多的组分入鼠数少的组：从随机表任取一数字除以该组鼠数，余数对应的动物放入鼠数少的组，直至每组动物数相同。

实验大鼠饲养于江苏省中医院实验动物中心，每笼一只，室温26℃，湿度45%～55%，人工光照，明暗各12 h，清洁安静，通风良好。

1.2 实验药品、试剂与仪器

复方地芬诺酯片：常州康普药业有限公司，批号1604009。电热恒温鼓风干燥机：上海博泰实验设备有限公司。阿拉伯树胶：广州南方化玻公司分装。活性炭：杭州木材总厂，参照文献[19]配置墨汁。AQP3抗体(ab125219)、AQP4抗体(ab9512)：ABCAM公司。ElivsionTMSupper即用型免疫组化试剂盒(批号1511189921)、DAB显色试剂盒(批号1508110031，20×)：福州迈新生物技术开发有限公司。BX41光学显微镜：OLYMPUS公司。

1.3 模型构建

各组处理方案见表1。

每5天称量体质量。计数大鼠24 h大便，取各组大便各40粒，称取湿重；放入电热恒温鼓风干燥机烘干，称取干重，计算含水量。观察造模前、造模后第1天、第7天大便计数及含水量。观察大鼠一般情况。

造模成功标准：大便颗粒计数减少、大便体积减小，外观干硬，质量较对照组小，含水量少于对照组。大鼠瘦小，毛发色泽度差。肠道炭墨推进程度较小，结肠留存大便数较多。

表1 各组大鼠处理方法

1.4 取材

便秘模型稳定后，停药7 d。禁食24 h后，活性炭墨灌胃；30 min后予10%水合氯醛4.5 ml/kg腹腔注射麻醉，解剖腹部，计数大鼠结肠留存大便粒数。取出幽门至回盲部上端肠道(小肠)，测量总长度及被炭墨黑染长度，计算炭墨推进率。

取部分升结肠，浸泡于4%多聚甲醛。

1.5 免疫组化

升结肠切片、烤片，脱蜡至水。过氧化物酶消除，抗原修复，封闭。加AQP3、AQP4一抗孵育，清洗；加二抗，清洗；加三抗，清洗；DAB染色，清洗；苏木素复染，清洗；脱水干燥，中性树胶封片，拍照。每组取15张切片，用Image-pro Plus 6.0分析图像平均光密度。

1.6 统计学分析

数据采用SPSS 19.0软件处理。计量资料以(xˉ±s)表示，数据经正态检验符合正态性分布，多组均数间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 模型评定

A组、B组均有2只大鼠死亡，C组、D组无大鼠死亡。D组大鼠明显瘦小，体质量小于C组，毛发暗黄，缺乏光泽；A组、B组间无明显差异。模型大鼠大便较其对照组数量少、体积小，干硬，两头尖细，含水量明显减少。停药7 d后与停药1 d相比，B组大便数有非常显著性差异(P＜0.01)；D组无显著性差异(P＞0.05)。见表2、表3。

表2 造模前后各组24 h大便粒数比较

表3 造模前后各组大便含水量比较(g)

炭墨推进率A组高于B组(P＜0.05)，C组明显高于D组(P＜0.01)，且D组低于B组(P＜0.05)。结肠留存大便粒数A组少于B组(P＜0.05)，C组明显少于D组(P＜0.01)，且D组明显多于B组(P＜0.01)。见表4。

表4 各组肠道炭墨推进率及存留大便粒数

2.2 免疫组化

各组均有AQP3阳性细胞，呈圆形、椭圆形褐色颗粒状，A组、B组之间，C组、D组之间均有显著性差异(P＜0.05)。B组、D组着色较深，分布以结肠黏膜顶部的绒毛上皮细胞为主，着色以细胞膜的顶部、基底及腔面为主，且顶部较基底、两侧膜表达多；杯状细胞少见。D组多于B组(P＜0.05)。见表5、图1。

AQP4在A组、C组表达较少，在B组、D组有一定表达，且以局灶表达为主。黏膜顶部高于底部，细胞基底面和腔面高于侧壁，吸收细胞表达明显而杯状细胞无表达。D组多于B组(P＜0.05)。见表5、图2。

表5 大鼠结肠AQP3、AQP4表达(平均光密度)

3 讨论

临床将便秘分为器质型便秘与功能型便秘，而功能型便秘又分为4类[21-22]：STC、排便障碍型便秘、混合型便秘、正常传输型便秘。其中STC临床上尤为常见[23]，以结肠传输时间延长、进食后结肠高振幅推进性收缩活动减少为特点[24]，以大便干燥、排出困难、便次减少、便意缺乏为主要症状[25]。

复方地芬诺酯主要成分是盐酸地芬诺酯和硫酸阿托品[26]。盐酸地芬诺酯是一种阿片生物碱，为哌替啶的衍生物，能与胃肠道平滑肌上的阿片受体结合，提高张力，减缓胃肠道蠕动；同时可直接抑制肠黏膜感受器，阻断局部黏膜蠕动反射，使肠内容物运输减慢，从而增加肠液再吸收，具有较强的止泻作用。硫酸阿托品是一种乙酰胆碱M受体阻断剂，能抑制胃肠道平滑肌运动，且能降低地芬诺酯的依赖性。

大鼠自然进食含有复方地芬诺酯的饲料，此造模方式耗时长达120 d，但造模完成7 d后未因停止用药而发生大便性状改变，表明该造模方式更稳定。与灌胃14 d方式相比，不仅大鼠死亡率降低，且更加符合人类便秘形成的过程。本研究显示，两种造模方式均能复制符合STC临床病理生理特点的大鼠模型，但进食复方地芬诺酯120 d复制的便秘模型更安全、稳定。

肠道水液代谢活跃。人体肠道每天转运9～10 L液体中，约8 L通过小肠吸收，约1.5 L通过结肠吸收。结肠重吸收水分主要部位在近端结肠上皮细胞，故升结肠水液代谢与便秘关系更为密切。

肠道水液代谢紊乱是STC发病的重要机制，尤其与结肠水转运异常相关。结肠上皮细胞排列紧密，细胞旁路水转运受限，故跨细胞膜转运成为结肠水分吸收的主要途径。AQP是跨膜通道蛋白的重要成员。哺乳动物体内存在13种亚型，消化系统有9种亚型表达，其中AQP1、AQP3、AQP4、AQP8、AQP9在结肠均有表达[7,16,27-28]。

图1 各组升结肠AQP3表达(免疫组织化学染色,40×)

图2 各组升结肠AQP4表达(免疫组织化学染色,40×)

本研究显示，AQP3、AQP4主要分布在近端结肠的吸收细胞而非杯状细胞，这与结肠重吸收水的部位和细胞一致，推测表达于结肠的AQP3、AQP4是水液吸收的重要通道之一。两种造模方式下，AQP3、AQP4表达有差异，进食复方地芬诺酯120 d后，AQP蛋白增多，水液吸收增多，结肠蠕动减缓，使便秘进一步发展。

多数通便药通便作用与AQP关系密切，AQP可能是多数通便药物的生物学基础[13]。

给予大鼠MgSO4溶液，2 h时结肠内渗透压达到峰值，但腹泻不明显；严重腹泻发生在给药后4～8 h；在给药后2 h渗透压最高时，AQP3表达较少，不能满足水运输需求，给药后4～8 h渗透压虽较2 h时下降，但此时AQP3水平处于峰值，大量水分从血管运输至肠腔[29]。故容积性通便药通便作用的关键环节不是升高渗透压，而是调节AQP3的表达。

刺激性通便药比沙可啶可直接刺激产生巨噬细胞，增加前列腺素E2的分泌，前列腺素E2作为旁分泌因子降低结肠黏膜上皮细胞AQP3表达，从而阻止水分从肠腔向血管转移，起到通便作用。

本研究显示，进食复方地芬诺酯120 d构建大鼠STC模型虽然耗时较长，饲料含药量调整频繁，但造模结果优于灌胃14 d造模，可以推广于便秘的实验研究。AQP3、AQP4在便秘结肠高表达，主要分布于上皮细胞，维持结肠的吸收功能。AQP在STC的形成、发展中发挥重要作用。针对AQP药物靶向治疗将成为治疗便秘的一个新突破点，并已逐渐取得一定进展[30]。

[1]冯雪建,卢占军,高登慧.大鼠灌胃给药方法的研究[J].实验动物科学与管理,2006,23(4):53-55.

[2]辛玉,张红星,周利.功能性便秘大鼠模型的研究进展[J].湖北中医杂志,2014,36(03):74-76.

[3]蒲春霞.水通道蛋白研究进展[J].成都大学学报(自然科学版),2010, 29(2):104-106.

[4]尹淑慧,孟荣贵.水通道与大肠内液体转运及便秘的关系[J].国际病理科学与临床杂志,2005,25(4):364-367.

[5]Ramirez-Lorca R,Vizuete ML,Venero JL,et al.Localization of aquaporin-3 mRNA and protein along the gastrointestinal tract of Wistar rats[J].PflugersArch,1999,438(1):94-100.

[6]Zeuthen T.Water-transporting proteins[J].J Membrane Biol,2010,234 (2):57-73.

[7]Laforenza U.Water channel proteins in the gastrointestinal tract[J]. MolAspects Med,2012,33(5/6):642-650.

[8]Ikarashi N,Kon R,Iizasa T,et al.Inhibition of aquaporin-3 water channel in the colon induces diarrhea[J].Biol Pharm Bull,2012,35(6): 957-962.

[9]中华医学会消化病学会胃肠动力学组,中华医学会外科学会结直肠外科肛门学组.中国慢性便秘诊治指南(2013,武汉)[J].胃肠病学, 2013,18(10):605-612.

[10]朱丽明,方秀才,刘诗,等.全国多中心慢性便秘患者情绪和睡眠状况的调查[J].中华医学杂志,2012,92(32):2243-2246.

[11]张雪芳,徐桂华,陈金珍,等.便秘的病因及治疗进展[J].中华全科医学,2009,7(11):1229-1331.

[12]Zhao GX,Li J,Wang JY,et al.Aquaporin 3 and 8 are down-regulated in TNBS-induced rat colitis[J].Biochem Biophys Res Commun,2014, 443(1):161-166.

[13]占煜,陈泰宇,唐诗宇,等.从水通道蛋白3介导的结肠水液代谢思考治疗慢性便秘的药物研究[J].川北医学院学报,2014,29(6):542-545.

[14]赵琼,陈为,汤朝晖,等.水通道蛋白4与胃肠道疾病[J].辽宁中医药大学学报,2010,12(1):35-37.

[15]Ma T,Verkman AS.Aquaporin water channels in gastrointestinal physiology[J].J Physiol,1999,517(2):317-326.

[16]Wang KS,Ma T,Filiz F,et al.Colon water transport in transgenic mice lacking aquaporin-4 water channels[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2000,279(2):G463-G470.

[17]宇永军.水通道蛋白AQP-1、AQP-4与慢传输型便秘的相关性研究[D].石家庄:河北医科大学,2010.

[18]赵伟,孙国志.常用实验动物随机分组方法[J].兽牧兽医科技信息, 2009(4):61-62.

[19]王晓玲,李亚妮,江梅,等.AQP4、AQP9在便秘小鼠结肠粘膜中的表达[J].胃肠病学和肝病学杂志,2015,24(4):421-423.

[20]钱海华,徐天舒,曾莉,等.通便颗粒调节慢传输型便秘大鼠结肠水通道蛋白3,水通道蛋白8表达的研究[J].中国实验方剂学杂志,2014, 20(24):180-184.

[21]Lembo A,Camilleri M.Chronic constipation[J].N Engl J Med,2003, 349(14):1360-1368.

[22]Shahid S,Ramzan Z,Maurer AH,et al.Chronic idiopathic constipation:more than a simple colonic transit disorder[J].J Clin Gastroenterol,2012,46(2):150-154.

[23]丁超,顾红,陈玉根,等.“养阴润肠方”用药分析及其治疗慢传输型便秘药理学探究[J].辽宁中医杂志,2014,41(11):2329-2331.

[24]Dinning PG,Zarate N,Hunt LM,et al.Pancolonicspatiotemporal mapping reveals regional deficiencies in,and disorganization of colonic propagating pressure waves in severe constipation[J].Neurogastroenterol Motil,2010,22(12):e340-e349.

[25]Bharucha AE,Wald AM.Anorectal disorders[J].Am J Gastroenterol, 2010,105(4):786-794.

[26]李震,郑豪,李国宾.水通道蛋白1在大鼠慢传输便秘模型结肠黏膜中的表达[J].中华实验外科杂志,2013,30(6):1259-1261.

[27]Jung JS,Bhat RV,Preston GM,et al.Molecular characterization of an aquaporin cDNA from brain:candidate osmoreceptor and regulator of water balance[J].Proc NatlAcad Sci USA,1994,91:13052-13056.

[28]王晓玲,李汀,江梅.水通道蛋白9在便秘型肠易激综合征患者结肠黏膜表达的研究[J].胃肠病学和肝病学杂志,2015,24(9):1095-1097.

[29]Ikarashi N,Ushiki T,Mochizuki T,et al.Effects of Magnesium sulphate administration on aquaporin 3 in rat gastrointestinal tract[J].Biol Pharm Bull,2011,34(2):238-242.

[30]辛军,孙天娇,张新,等.水通道蛋白分子靶向治疗和分子靶向成像研究进展[J].中国临床医学影像杂志,2014,25(11):807-810.

Comparison of Two Kinds of Rat Model for Slow Transit Constipation and Expression ofAquaporins in Them

JI Tian-li,QIAN Hai-hua
The First Clinical College,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing,Jiangsu 210029,China

QIAN Hai-hua.E-mail:haihuaqian@126.com

Objective To compare the rat model of slow transit constipation(STC)established with gavage or feeding compound diphenoxylate.Methods Forty Sprague-Dawley rats were randomly divided into gavage control group(A),gavage group(B),feeding control group(C)and feeding group(D)equally.Group B was given compound diphenoxylate suspension by gavage for 14 days while group A accepted isodose normal saline.Group D were given feed containing compound diphenoxylate for 120 days while group C accepted normal feed.Carbon ink was poured into stomachs to observe the propelling rate after modeling,and the content of aquaporin 3 and aquaporin 4 were detected with immunohistochemistry.Results There were two rats died in group A and group B,respectively.The carbon ink propelling rate was lower in group D than in group B(P＜0.05).Both aquaporin 3 and aquaporin 4 were more in group D than in group B(P＜0.05). Conclusion STC rat model can be established by eating diphenoxylate feed for 120 days,which is safer and more stable than that of gavage for 14 days.Aquaporins in colons may play a role in onset and development of STC.

slow transit constipation;model;aquaporin;rats

R574.62

A

1006-9771(2017)05-0529-05

2016-12-22

2017-02-13)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.05.008

[本文著录格式]姬甜丽，钱海华.两种不同慢传输便秘大鼠模型构建方法比较及对水通道蛋白的影响[J].中国康复理论与实践,2017,23(5):529-533.

CITED AS:Ji TL,Qian HH.Comparison of two kinds of rat model for slow transit constipation and expression of aquaporins in them[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(5):529-533.

国家自然科学基金项目(No.81573979)。

南京中医药大学第一临床医学院，江苏南京市210029。作者简介：姬甜丽(1990-)，女，汉族，山西高平市人，硕士研究生，主要研究方向：中医药治疗肛肠疾病。通讯作者：钱海华，男，江苏苏州市人，博士，主任中医师，主要研究方向：中医药治疗肛肠疾病。E-mail: haihuaqian@126.com。