跑台运动对脑外伤大鼠基质金属蛋白酶-2表达的影响①

沈夏锋，田 闪，吴 毅，朱玉连

跑台运动对脑外伤大鼠基质金属蛋白酶-2表达的影响①

沈夏锋1，田 闪2，吴 毅2，朱玉连2

目的观察跑台训练对脑外伤大鼠基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响。方法55只成年Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组(n=15)、对照组(n=20)和运动组(n=20)，后两组复制中重度脑外伤模型，运动组进行电动跑台训练1周。术后6、12、18、24 d，采用足误试验评定运动协调功能；术后48 h，采用伊文思蓝(EB)染色检测大鼠血脑屏障通透性；术后7 d，Western blotting检测MMP-2的表达。结果运动组在术后6 d评分明显降低，但随后增高，其中12 d、18 d及24 d评分比对照组高(F＞4.793, P＜0.05)；运动组EB渗出量显著减少(t=-8.091,P＜0.001)；运动组MMP-2蛋白表达显著下降(t=-13.12,P＜0.001)。结论大鼠脑外伤后早期进行跑台训练，可改善运动功能，可能与抑制MMP-2，从而减轻血脑屏障破坏有关。

脑外伤；跑台训练；血脑屏障；基质金属蛋白酶；大鼠

脑外伤的病理生理过程包括原发性损伤和继发性损伤[1]。原发性损伤直接由创伤引起，继发性损伤持续时间较长，包括脑水肿、谷氨酸兴奋性中毒、脂质过氧化、血脑屏障破坏、线粒体功能失调、炎症、凋亡和细胞坏死等复杂的病理过程和级联反应[2-4]。最近研究表明，血脑屏障的破坏贯穿于脑外伤原发性和继发性损伤，在脑外伤病理生理中占据重要地位，是脑外伤治疗的新方向[5-8]。

运动训练是一组以身体锻炼为主的治疗方法，在国内外脑外伤后康复治疗中应用广泛，疗效显著。有研究表明，运动训练可以减轻脑外伤大鼠的神经功能障碍，促进运动能力和学习记忆能力的恢复[9-12]。基于血脑屏障的完整性对脑外伤病理发展的重要意义，早期运动训练对脑损伤后血脑屏障及相关的基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases 2,MMP-2)的影响目前还缺乏相关研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康成年Sprague-Dawley大鼠55只，体质量250～270 g，由上海西普尔·必凯实验动物有限公司提供，采用随机数字表法分成假手术组15只、对照组20只和运动组20只。

1.2 造模方法

异氟醚吸入诱导麻醉，大鼠俯卧位固定于操作台上，异氟醚全身麻醉。额顶部剃毛、消毒，沿中线矢状线切开皮肤，暴露颅顶骨，用牙科电钻沿中线右旁5 mm前囟部位做直径5 mm骨窗，暴露完整硬脑膜。使用控制性皮质冲击颅脑损伤仪器(PSI公司)，不锈钢打击头对准骨窗，速度4 m/s、深度3.2 mm撞击，造成运动组和对照组大鼠中重度脑外伤[8]。小心止血、缝合。大鼠出现部分反射活动消失、对侧肢体功能障碍等表现，提示造模成功。

假手术组大鼠同法暴露硬脑膜，不进行撞击，直接止血和缝合伤口。

1.3 干预方法

运动组从术后1 d起，每天在DSPT-202电动跑台(立泰生物科技有限公司)上行运动干预，倾角0°，速度3 m/min，运动30 min，共1周。对照组和假手术组每天置于跑台机上30 min，倾角0°，速度0。

1.4 观察指标

1.4.1 足误试验

运动组和对照组各取12只大鼠，假手术组取7只大鼠，分别于术后6 d、12 d、18 d及24 d，参考Gerlinde介绍的操作步骤进行测评[12-13]。0分：左前爪完全踩空，未触到横档即掉下，身体失去正常姿势和平衡。1分：左前爪能放在横档上，但当该爪承重时滑下，同时大鼠掉落，影响正常行走。2分：左前爪能放在横档上，但当该爪承重时滑下，大鼠未掉落，也不影响行走，能维持平衡和正常步态。3分：左前爪能放在横档上，但在承重前大鼠迅速抬起该爪并移到另一个横档上。4分：大鼠想将前爪放到一个横档上，但因没接触到该横档而放在另一横档上。5分：大鼠将左前爪放在横档上，但由腕关节、肘关节或爪趾承重。6分：大鼠能将左前爪正中部位放在横档上。

1.4.2 血脑屏障完整性检测

术后48 h，每组各取5只大鼠，经左股静脉注入2%伊文思蓝(Evans blue,EB)5 ml/kg。3 h后10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，左心室灌注生理盐水300 ml，断头取脑，将损伤侧脑组织浸泡在甲酰胺800 μl中，60℃避光48 h。离心取上清液，用酶标仪检测(λ=632 nm)光密度值。每个样本重复检测3次。根据标准曲线计算大鼠脑组织中EB含量(μg/g)。

1.4.3 Western blotting

术后7 d，每组3只大鼠10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，断头取脑，迅速于冰上分离大脑皮层，干冰速冻，-80℃冰箱保存。匀浆，冰上超声裂解。4℃、14,000 g离心30 min，取上清。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。配分离胶和积层胶，上样量50 μg，60 V电泳至样品进入分离胶中，100 V电泳至溴酚蓝至凝胶末端；转膜电压100 V，时间90 min，5%脱脂奶粉室温封闭l h。加MMP-2抗体(1∶1500，ABCAM公司)，室温振荡1 h，4℃过夜。GAPDH(1∶1500，EPITOMICS公司)作为内参。加HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶4000，上海舒济生物公司)，室温振荡l h。加荧光显影剂，凝胶成像系统成像，Quantity One图像分析系统(BIO-RAD公司)分析蛋白条带光密度。将假手术组光密度设为1，计算运动组和对照组光密度与假手术组光密度的比值。

1.5 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行分析。数据以(xˉ±s)表示，足误试验评分采用重复测量方差分析，血脑屏障和Western blotting数据采用独立样本t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 足误试验

假手术组足误评分5.5分左右。对照组术后6 d评分明显降低，以后无明显增高的趋势，基本稳定在4.2分左右。运动组术后6 d评分降低，12 d、18 d及24 d评分有所升高，且高于对照组(P＜0.05)。见表1。

表1 运动组与对照组各时间点足误试验评分比较

2.2 血脑屏障完整性

假手术组基本未见蓝染组织。对照组皮层和胼胝体明显呈蓝色，运动组皮层和胼胝体蓝染组织减少。运动组EB渗出量(14.6±1.14)μg/g，显著低于对照组(23.5±2.18)μg/g(t=-8.091,P＜0.001)。

2.3 Western blotting

对照组MMP-2蛋白相对表达量为(2.51±0.11)，显著高于运动组(1.58±0.17)(t=-13.12,P＜0.001)。见图1。

图1 各组Western blotting结果

3 讨论

血脑屏障主要由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞终足、基底膜和周细胞构成。脑微血管内皮细胞依靠紧密连接构成一个连续密闭的屏障，不仅防止血液循环中的大分子物质进入脑实质，也承担必要的物质交换，是维持神经系统内稳定的重要成分。血脑屏障受损可增加血源性中性粒细胞和白细胞在损伤血管内皮细胞处聚集和穿越至脑实质，加剧脑实质神经炎性反应，加重脑损伤[13]。

脑水肿是脑外伤急性期重要的病理过程，表现为脑组织含水量和脑体积增高。脑外伤引发脑水肿主要有两种机制，即细胞毒性脑水肿和血管源性脑水肿。MMPs是一组Zn2+依赖的可降解或修饰细胞外基质的蛋白酶，生理状态下以酶原形式存在。细胞毒性水肿后细胞持续肿胀，引起细胞坏死，脑局部渗透状态改变，激活MMPs；激活的MMPs可降解基底膜Ⅳ型胶原等成分，破坏血脑屏障完整性，从而引起毛细血管通透性增加，导致血浆成分和大分子物质外渗，形成血管源性脑水肿和出血转化，进一步恶化脑水肿[14-16]。

许多脑外伤动物模型显示，MMP-2和MMP-9在脑外伤后数小时至数天表达显著增加[17-19]。临床上中重度脑外伤患者血浆和脑脊液可检测到MMP-2和MMP-9升高[20-21]。MMP-2和MMP-9的高表达与ICU住院时间延长和死亡率增高密切相关[22-23]。目前普遍认为，MMPs表达上调和活性增强是早期脑损伤的重要因素之一[24]。

本研究显示，早期运动训练能改善脑外伤大鼠运动协调功能，与以前的报道一致[9-12]。本研究也发现，脑外伤后大鼠血脑屏障破坏[25]，通透性增加；而运动训练能减轻脑外伤后血脑屏障的破坏，一定程度上维持血脑屏障的完整性。这可能与抑制脑外伤后MMP-2蛋白表达增加有关。

由于神经炎症和免疫与血脑屏障的密切联系，在这些方面展开研究可能为进一步阐明脑外伤后康复的作用机制提供依据。

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Effect of Treadmill Exercise on Expression of Matrix Metalloproteinase-2 in Rats with Traumatic Brain Injury

SHEN Xia-feng1,TIAN Shan2,WU Yi2,ZHU Yu-lian2
1.Department of Rehabilitation Medicine,The First Rehabilitaion Hospital of Shanghai,Shanghai 200092,China; 2.Department of Rehabilitation,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China

ZHU Yu-lian.E-mail:hsyykfkzyl@163.com

Objective To determine the effect of treadmill exercise on expression of matrix metalloproteinase-2(MMP-2)in rats following traumatic brain injury(TBI).Methods Fifty-five male adult Sprague-Dawley rats were randomly assigned to sham(n=15),control(n= 20)and exercise(n=20)groups,the later two groups subjected to unilateral cortical contusion injury(CCI).All the rats were assessed with foot-fault test 6,12,18 and 24 days after CCI.Evans blue perfusion was used to evaluate the integrity of the blood-brain-barrier(BBB)48 hours after CCI.Protein expression of MMP-2 was determined with Western blotting one week after CCI.Results The score of foot-fault test improved more in the exercise group than in the control group 12,18 and 24 days after CCI(F＞4.793,P＜0.05).Evans blue extravasation was less in the exercise group than in the control group(t=-8.091,P＜0.001),as well as the expression of MMP-2(t=-13.12,P＜0.001). Conclusion Early treadmill exercise can improve the motor function in rats with TBI,which may associate with inhibition of MMP-2 expression to protect BBB integrity.

traumatic brain injury;treadmill exercise;blood-brain-barrier;matrix metalloproteinase;rats

R651.1

A

1006-9771(2017)05-0525-04

2017-03-08

2017-04-11)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.05.007

[本文著录格式]沈夏锋，田闪，吴毅，等.跑台运动对脑外伤大鼠基质金属蛋白酶-2表达的影响[J].中国康复理论与实践, 2017,23(5):525-528.

CITED AS:Shen XF,Tian S,Wu Y,et al.Effect of treadmill exercise on expression of matrix metalloproteinase-2 in rats with traumatic brain injury[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(5):525-528.

杨浦区科学技术委员会、卫生和计划生育委员会课题(No.YP15M13)。

1.上海市第一康复医院康复科，上海市200092；2.复旦大学附属华山医院康复医学科，上海市200040。作者简介：沈夏锋(1970-)，男，汉族，浙江苍南县人，副主任医师，主要研究方向：神经康复。通讯作者：朱玉连。E-mail:hsyykfkzyl@163.com。