基于PCR-RDB法对陕西地区HCV基因型别的研究

杨柳 李金洁 苏明权 常亮 李蕊 马越云 郝晓柯

基于PCR-RDB法对陕西地区HCV基因型别的研究

杨柳 李金洁 苏明权 常亮 李蕊 马越云 郝晓柯★

目的 探讨聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）-反向点杂交法（reverse dot blot，RDB）在陕西地区丙型肝炎病毒基因分型中的应用。 方法 选取陕西地区610例丙型肝炎患者，利用PCR-RDB法进行丙肝病毒基因型检测，并使用SPSS对检测结果进行统计学分析。 结果 610例丙肝患者检出1b型273例（44.75%），2a型286例（46.89%），3a型30例（4.92%），3b型11例（1.80%），6a 型10例（1.64%）；各基因型间的患者性别比例的差异具有统计学意义（P＜0.05）；与其他基因型别相比，HCV 3a型患者年龄水平最低，差异显著（P＜0.05）。 结论 陕西地区丙肝病毒以2a、1b型为主，患者性别及年龄与所感染HCV型别有关联性；PCR-RDB技术在丙型肝炎病毒基因分型中的应用有利于HCV分型在临床上的推广。

丙型肝炎病毒；基因分型；PCR-反向点杂交

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是一种单股线性正链RNA黄病毒。全世界约有1.7亿人受到HCV的感染［1］，我国HCV感染者达3 800万，感染率为1.8%～3.7%，占全球HCV感染的15%～30%［2］。感染HCV可导致肝脏发生炎症坏死和纤维化，部分丙型肝炎患者可以发展为肝硬化甚至肝癌［3］，对患者健康威胁极大，给其家庭带来沉重的经济负担和精神压力。

由于HCV RNA复制所依赖的聚合酶缺乏校正功能，HCV基因组呈现高度异质性［4］。根据Simmonds等人研究［5］，利用核酸测序和进化树分析结果，确定了目前国际通用的HCV基因型命名系统，将HCV分为6种主要的基因型（用数字1～6表示）和100多个基因亚型（用小写英文字母表示）。不同HCV基因型感染者的临床表现及抗病毒治疗的效果不同［6］，1型HCV感染在进行干扰素或口服抗病毒治疗时的敏感性及预后均较差，治疗周期也更长［7］。除此之外，HCV基因型分布具有明显的地域差异性和人群差异性［8-9］。我国常见的HCV基因型为1b和2a，3型主要见于云南、广西及珠三角地区，6型主要见于香港和澳门地区［10］。因此，HCV基因型别是制定丙肝治疗方案、进行预后判断及流行病学研究的重要指标［11］。

目前，进行HCV基因分型的方法有很多，测序法作为金标准，结果准确可靠，但其费时费力，不利于临床开展的普及，而本研究采用的PCR-反向点杂交法具有特异性和准确性高，且简便、高效、经济等特点。本文通过对陕西地区丙型肝炎患者基因型别分布进行分析和研究，了解本地区最新HCV流行病学特点，以更好地指导丙型肝炎的诊断、治疗及预后判断。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2015年1月至2016年3月来自西京医院住院及门诊就诊的HCV患者610例血清标本，其中男性265例，女性345例，年龄在16～83岁间，平均年龄（48.21±13.65）岁；上述患者诊断均符合中国肝炎防治基金会、中华医学会肝病学分会和感染病学分会联合发布的中国《丙型肝炎防治指南（2015年更新版）》中的诊断标准［12］，且HCV RNA定量检测结果高于5×103IU/mL。

1.2 主要试剂及仪器

丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒（PCR-反向点杂交法）（中山大学达安基因股份有限公司）；ABI 2720型PCR仪（Applied biosystems，美国）；THZ-82型电热恒温振荡水槽（中国常州菲普实验仪器厂）；Z216 MK型微量高速冷冻型离心机（Hermle，德国）；K20型干式恒温器（中国杭州奥盛仪器有限公司）；15 mL及50 mL离心管（Corning，美国）。

1.3 HCV基因分型

1.3.1 血浆HCV总RNA提取

用EDTA抗凝采血管抽取受检者静脉血4 mL，1 500 r/min离心2 min，吸取上层血浆200 μL用于HCV RNA提取。按照广州达安丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒（PCR-反向点杂交法）中RNA提取说明，进行待测标本及阴阳性质控品RNA提取，得到的RNA提取液可直接用于RT-PCR，或置于-20℃冻存备用。

1.3.2 RT-PCR扩增

按照广州达安丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒（PCR-反向点杂交法）说明书进行RT-PCR扩增。扩增总体系50 μL：酶系、引物、PCR buffer混合液20 μL，1.3.1中RNA提取液30 μL（待测标本及阴阳性质控品），两者混合后瞬时离心，将反应管放入PCR仪，按下列条件扩增：50℃逆转录25 min；95℃预变性15 min；94℃30 s、55℃40 s、72℃45 s共45次循环；72℃延伸7 min。PCR产物可直接进行杂交反应，或置于4℃短期保存，或置于-20℃长期冻存。

1.3.3 杂交反应及结果判读

严格按照广州达安丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒（PCR-反向点杂交法）中杂交反应说明书进行。其步骤包括预杂交、杂交、洗膜、显色、结果判读。HCV基因分型杂交膜条上共12个位点，其中位点G1～G10为各型别检测探针，PC为扩增控制点，CC为显色控制点，位点排列如图1所示。根据说明书要求，可将CC点、PC点和各型别位点cut off值预设在分析软件中，分析结束后由软件自动生成各位点信号值、阴阳性和相应的HCV型别；也可参照结果分析表肉眼进行结果判读，HCV基因型常见结果分析表见表1。本文患者HCV型别均由肉眼判读所得。

图1 HCV基因分型杂交膜条位点排列Figure 1 Sequencing of hybridization membrane strip sites of HCV genotyping

表1HCV基因分型常见结果分析表Table 1 Analysis of major HCV genotypes

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 16.0进行统计学分析，计量资料应用t检验，计数资料用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 陕西地区HCV的流行病学特点

本次研究使用PCR-RDB法丙肝分型试剂对选取样本进行了5种基因亚型的检测，包括1b亚型，2a亚型，3a亚型，3b亚型和6a亚型。对610例陕西地区HCV患者的基因型及型别特点进行统计，见表2。结果显示，陕西地区HCV型别以2a和1b型为主，分别占总比率的46.89%（286/610）和44.75%（273/610），3a型占4.92%（30/610），3b型占1.80%（11/610），6a型占1.64%（10/610），未见上述型别的混合感染。

表2 陕西地区HCV流行病学概况Table 2 The epidemiological overview of HCV subtypes in Shanxi Province

2.2 不同HCV基因型中男女性别比例

采用卡方检验，5组基因亚型间的患者性别比例有显著差异，其中HCV女性患者明显多于男性（χ2= 15.047，P＜0.005），见表3。同时，由表2可看出在各个亚组中，1b亚型和2a亚型中女性患者多于男性，而3a亚型、3b亚型及6a亚型中男性多于女性。

2.3 不同HCV基因型中患者年龄水平的分析

对5种基因亚型的患者年龄水平进行统计与分析，如表4所示。结果显示，HCV 2a型的平均年龄最高，为（49.42±13.66）岁，3a型的平均年龄最小，为（36.47±11.18）岁。对5组年龄进行单因素方差分析（one-way ANOVA），发现5种基因亚型之间年龄存在显著差异（F=7.367，P＜0.000 1），再采用Tukey-test法进行两两比较（表5），发现3a型患者平均年龄水平显著低于1b型和2a型（P＜0.000 1）。

表3 HCV各基因型患者性别比例［n（%）］Table 3 The gender ratios among different subtypes of HCV［n（%）］

表4 HCV不同基因型患者平均年龄（±s）Table 4 Patients’average ages among different genotypes of HCV（±s）

表4 HCV不同基因型患者平均年龄（±s）Table 4 Patients’average ages among different genotypes of HCV（±s）

F P年龄均值（岁）基因亚型1b 48.65±13.38 2a 49.42±13.66 3a 36.47±11.18 3b 44.09±12.63 6a 41.3±11.15合计48.21±13.657.367＜0.000 1

表5 HCV不同基因型患者年龄水平的两两比较Table 5 Pairwise comparison of the ages between different genotypes of HCV

3 讨论

根据全球分离毒株，目前丙肝病毒至少包括6种基因型多种基因亚型［13］。HCV基因型分布具有显著地理差异，其中HCV 1～3型呈世界范围分布［14］，中国大体上以1b和2a型为主。本研究表明陕西地区丙型肝炎患者仍以这两种基因型为主，且2a型患者略多于1b型，这与以往报道的1b型患者比例最高有所不同，可能与标本来源只局限于医院，且与标本量有限有关。本研究中，我们分析了各基因亚型的性别构成发现，各基因亚型中患者性别比例有所不同，HCV 1b和2a亚型中女性比例较大。1b和2a基因亚型感染途径多来自不洁输血［2］，在1993年严格进行HCV血筛之前，输血及血制品导致其大面积传播。女性由于其特殊生理结构，需经历生育等过程，增加了输血概率，从而增加了感染的可能性。研究［2］表明，3型感染主要来自静脉药瘾人群，东南亚作为全球毒品生产销售基地，是3型HCV的主要流行地区，而云南、贵州、重庆及广西等地作为毒品进入我国的窗口，也使3型HCV逐渐流入我国。本研究检测出了一定比例的3a和3b亚型，且其年龄分布与1b 及2a型明显不同，其中3a亚型较1b和2a亚型患者平均年龄明显偏小，3a型患者年龄多小于40岁。这一结果间接证实对献血人群抗HCV筛查后，丙肝传播途径发生转变，并由此引起后续丙肝病毒感染基因亚型的变化［15］。

丙肝病毒基因型不仅是流行病学研究的主要指标，在临床治疗中也具有重要指导意义。研究［16-17］表明，1型HCV感染在使用干扰素治疗中较难获得病毒学持续应答（sustained virologic response，SVR），且治疗时间长，治疗剂量大，联合用药剂量也要加大，预后效果较其他型别欠佳。近几年研发的HCV口服抗病毒药物如Sofosbuvir、Daclatasvir等［18-19］，同样在1型及4型HCV的治疗中也需要处长服药时间。因此，HCV基因型别可以作为抗病毒药物治疗慢性丙型肝炎是否有效的预测因素，检测HCV基因型有助于判断丙肝患者治疗的难易程度，制定个体化抗病毒治疗方案。2015年10月25日，中国肝炎防治基金会、中华医学会肝病学分会和感染病学分会在北京共同发布的《丙型肝炎防治指南》中指出［12］，丙肝临床治疗中除进行HCV抗体、抗原及病毒载量检测外，还要进行HCV基因分型和HCV耐药相关基因检测，以及患者IL28B基因分型检测。

随着分子生物学技术不断发展，检测HCV基因型的方法出现了很多。其中测序法［20］是HCV基因分型的“金标准”，它不仅可以检测基因型，还可以发现新的突变。但其操作繁琐，仪器设备复杂，检测周期长、成本高，中小型医院难以实现和开展，不利于HCV基因分型的普及。本文选择的PCR-RDB法是通过将生物素或荧光素标记型特异性探针固相化在尼龙膜上，再与RT-PCR扩增的病毒产物进行杂交后，最终经纸条肉眼判读出HCV基因型的分型方法。此法不需要昂贵复杂的仪器设备，其使用的PCR技术及RDB技术也都是发展成熟、操作简便易于掌握的生物技术，在普通的分子生物学实验室及临床实验室均可开展。结合以往相关研究［21-22］，核酸分子杂交技术具有良好的特异性、准确性及灵敏度，并且实现了高通量、高效率和低成本，能够满足临床HCV分型的需求。值得注意的是，PCR-RDB法HCV分型目前尚未包含所有基因亚型，针对PCR-RDB法无法完成分型的型别如1a型、2b型等，临床上将建议患者进行测序法基因分型检测验证，这也是PCR-RDB法的弊端和需要完善的方面。

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Investigation of HCV genotypes with PCR-RDB in Shaanxi

YANG Liu，LI Jinjie，SU Mingquan，CHANG Liang，LI Rui，MA Yueyun，HAO Xiaoke★
（Department of Clinical Laboratory，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi’an，Shaanxi, China，710032）

Objective To discuss the application of RDB-PCR method in HCV genotyping in Shaanxi Province.Methods HCV genotypes were detected in 610 serum samples of chronic hepatitis C patients from Shaanxi province with RDB-PCR.SPSS was used for statistical analysis of the data. Results Out of 610 cases,273 cases(44.75%)were genotype 1b,286 cases(46.89%)were genotype 2a,30 cases(4.92%) were genotype 3a,11 cases(1.80%)were genotype 3b,and 10 cases(1.64%)were genotype 6a.There were significant differences on the gender ratios among different genotypes of HCV（P＜0.05）.Compared with other genotypes,the patients of HCV 3a had the lowest average age（P＜0.05）. Conclusion The genotypes 2a and 1b are the main HCV genotypes in Shaanxi Province.It indicated that the HCV genotype was associated with gender and age.The application of PCR-RDB will facilitate the popularization of HCV genotyping in clinical laboratories.

Hepatitis C virus；Genotype；PCR-RDB

第四军医大学第一附属医院西京医院检验科，陕西，西安710032

★通讯作者：郝晓柯，E-mail：haoxkg@fmmu.edu.cn