舌下含服粉尘螨滴剂脱敏治疗对特应性皮炎患者中辅助性T细胞作用的研究

曾美李庆祥 黄文富 陈俊钊 刘金花 王翠彦

舌下含服粉尘螨滴剂脱敏治疗对特应性皮炎患者中辅助性T细胞作用的研究

曾美★李庆祥 黄文富 陈俊钊 刘金花 王翠彦

目的 探讨舌下含服粉尘螨滴剂脱敏治疗对特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）患者辅助性T细胞（T helper cells，Th）的作用。方法 用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）方法检测AD患者舌下含服粉尘螨滴剂组（sublingual immunotherapy，SLIT组）和对照组治疗前后的外周血Th1（IFN-γ）、Th2（IL-4）、Th17（IL-17）的水平，用流式细胞技术检测两组治疗前后的调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）数量。然后用两独立样本t或校正t（t’）检验对两组患者治疗前和治疗后的组内以及治疗后组间的IFN-γ、IL-4、IL-17和Treg水平分别进行对比研究。结果 SLIT组治疗后IL-4、IL-17较治疗前明显下降，IFN-γ和Treg较治疗前明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。且SLIT组治疗后较对照组治疗后IL-4、IL-17下降更明显，IFN-γ升高更明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。SLIT组治疗后Treg细胞数量较对照组治疗后升高更多，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 在AD患者中，舌下含服粉尘螨滴剂治疗能降低其外周血IL-4、IL-17，升高IFN-γ和Treg水平而达到治疗的目的。

特应性皮炎；辅助性T细胞；粉尘螨滴剂；调节性T细胞

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种慢性、瘙痒性、复发性的炎症性皮肤病。既往有研究表明辅助性T细胞（T helper cells，Th）参与了AD的发病［1-3］。辅助性T细胞根据释放细胞因子不同可分为不同的亚型：Th1、Th2、调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）和Th17。

粉尘螨是诱发AD的重要变应原之一，已有学者研究显示在AD同类疾病过敏性鼻炎患者中粉尘螨是最重要过敏原［4］。舌下含服粉尘螨滴剂在过敏性疾病中的安全性和有效性已被大量学者研究证实［5-7］。但在特应性皮炎患者中，舌下含服粉尘螨滴剂的免疫学机制尚不明确，其对Th细胞的影响亦未见文献报道［8］。本文拟通过以下研究以探讨舌下含服粉尘螨滴剂对AD患者辅助性T细胞的影响，从而更好地指导临床治疗。

1 对象和方法

1.1 研究对象

所选病例为2015年2月至2016年4月就诊于我院皮肤科门诊的AD患者52例。其中男24例，女28例。入选标准：①符合Hanifin和Rajka诊断标准［9］；②年龄4岁以上；③患者本人或儿童的监护人同意参加实验（签署知情同意书）；④过敏原检测（皮肤点刺试验）显示粉尘螨阳性，粉尘螨点刺（++）以上，且为单一粉尘螨阳性或屋尘螨、粉尘螨均阳性。排除标准：①入选前2周内有局部外用药物史者；②入选前2周内有口服抗阻胺药物史者；③患有系统性疾病者；④有系统使用免疫抑制剂及糖皮质激素史者；⑤孕妇或哺乳期妇女。采用随机双盲对照的方法将52例AD患者分为舌下含服粉尘螨滴剂组（sublingual immunotherapy，SLIT组）和对照组，每组26例。SLIT组：男11例，女15例，年龄4～52岁，平均年龄27.5岁；对照组男13例，女13例，年龄5～55岁，平均年龄29.1岁。两组患者年龄性别差异均无统计学意义。两组患者治疗前均进行SCORAD（Scoring Atopic Dermatitis）［10］积分，SLIT组（31.34±7.12）分，对照组（33.56±8.69）分，两组治疗前基线差异无统计学意义（P＞0.05）。本次伦理由惠州市中心人民医院伦理委员会审批通过。

1.2 仪器试剂和试验药物

仪器：全自动酶标仪芬兰产Multiskan MK3型、全自动洗板机芬兰产wenwash-4 MK2型（芬兰雷勃），流式细胞仪BD FACSCantoTMⅡ（BD公司，美国）。

试剂：人白介素4（interleukin-4，IL-4）、人干扰素（interferon-γ，lFN-γ）、人白介素17（interleukin-17，IL-17）、ELISA试剂盒均由武汉华美生物工程有限公司进口分装自美国CUSABIO公司。CD3 （FITC-A）、CD45（PerCP-A）、CD4（APC-A）、CD25 （PE-Cy7-A）以及不同荧光标记的同型对照均购自美国BD公司。

试验药物：粉尘螨滴剂（浙江我武生物科技股份有限公司），盐酸西替利嗪分散片（宜昌长江药业有限公司），糠酸莫米松乳膏（上海先灵葆雅制药有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法

对照组仅给予口服盐酸西替利嗪分散片及外用糠酸莫米松乳膏治疗，SLIT组在给予口服盐酸西替利嗪分散片及外用糠酸莫米松乳膏治疗的同时，给予粉尘螨滴剂舌下含服脱敏治疗，治疗时间半年。SLIT组脱敏治疗分为递增期和维持期，治疗疫苗使用粉尘螨滴剂。递增期1～3周，第1～3周分别服用粉尘螨滴剂1号（1 μg/mL）、2号（10 μg/ mL）和3号（100 μg/mL），1～3号从第1天到第7天服用剂量分别为1、2、3、4、6、8、10滴；第4周开始，儿童患者使用4号（333 μg/mL）维持，qd，每次3滴。14岁及以上患者从第6周开始使用5号（1 000 μg/mL）维持，qd，每次2滴，直至疗程结束。服用方法：滴于舌下含1～3 min后吞咽，每天固定时间服用1次。

1.3.2 疗效判定标准

有效率采用SCORAD计分系统［10］，评价患者的病情严重程度。通过计算评分下降指数来评价疗效。评分下降指数=［（治疗前SCORAD积分-治疗后SCORAD积分）／治疗前SCORAD积分］×100%。评分下降指数≥90%为痊愈，评分下降指数60%～89%为显效，评分下降指数20%～59%为好转，评分下降指数≤19%为无效。总有效率=［（痊愈+显效）/总例数］× 100%［10］。

1.3.3 ELISA方法

每位患者治疗前和治疗后各抽取静脉血5 mL室温下静置2 h，3 000 r/min离心15 min，分离血清于冻存管中-80℃冰箱保存。IL-4、IFN-r、IL-17用ELISA法按说明书步骤检测。

1.3.4 流式细胞技术

外周血CD4+CD25+Treg的检测：取EDTA抗凝血100 μL置于FCM测量管中，加入鼠抗人单克隆抗体CD3（FITC-A）、CD45（PerCP-A）、CD4（APCA）、CD25（PE-Cy7-A）各10 μL，充分混匀，在4℃冰箱中反应30 min。FACS洗涤液（含0.5%BSA，0.01%叠氮钠的PBS）洗涤2次，1 000 r/min离心3 min。再加入2 mL红细胞裂解液，充分混匀，4℃冰箱中反应10 min，直至细胞悬液变成真性溶液，1 000 r/min离心3 min。FACS洗涤液洗涤2次。1%多聚甲醛500 μL重悬固定，FACSAria流式细胞仪检测，BD FACS专用FACSDIVA软件分析。设有mIgG-CD25同型对照。前向散射光（forward scatter，FSC）和CD45以淋巴细胞群设门，测定SLIT组和对照组CD4+CD25+细胞占CD3+细胞的百分率。

1.4 统计学分析

数据用SPSS 13.0进行统计分析，显著性检验水平为α=0.05。计量资料以±s表示，两独立样本的比较，服从正态分布者用t或校正t（t′）检验。两组间有效率比较采用卡方检验。

2 结果

2.1 临床疗效结果

治疗半年后，SLIT组有效率为61.54%，对照组有效率为23.07%，SLIT组有效率明显高对于对照组，有统计学差异（χ2=7.87，P=0.005），见表1。

表1 SLIT组和对照组疗效的比较Table 1 The comparison of curative effect between the SLIT group and the control one

2.2 IL-4、IFN-γ、IL-17及Treg的结果

SLIT组及对照组IL-4水平治疗后较治疗前均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。且两组治疗后相比：SLIT组较对照组降低更明显，差异有统计学意义（P＜0.01）。SLIT组及对照组IFN-γ水平治疗后较治疗前明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），且两组治疗后相比，SLIT组较对照组升高更明显，差异有统计学意义（P＜0.01），详见表2。

表2 SLIT组和对照组治疗前后IL-4、IFN-γ的比较Table 2 The comparison of IL-4 and IFN-γ before and after treatment in the SLIT group and the control one

SLIT组IL-17水平治疗后较治疗前明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。SLIT组IL-17水平治疗后较治疗前明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01），对照组IL-17水平治疗后较治疗前有所下降，但差异无统计学意义（P= 0.299）。两组治疗后相比，SLIT组IL-17水平较对照组降低更明显，差异有统计学意义（P= 0.001）。CD3+CD4+CD25+Treg细胞：SLIT组治疗前为（3.51±1.09）%；治疗后为（5.32±1.27）%。治疗后较治疗前明显升高，差异有统计学意义（t=-3.94，P＜0.01）。对照组治疗前为（3.62± 1.49）%；治疗后为（4.78±1.56）%。治疗后比治疗前有所升高，但差异无统计学意义（t=-1.694，P=0.108）。两组治疗后相比：SLIT组较对照组升高更明显，但差异无统计学意义（t=0.829，P= 0.418），详见表3、图1。

表3 SLIT组和对照组治疗前后IL-17、Treg的比较Table 3 The comparison of IL-17 and Treg before and after treatment in the SLIT group and the control one

图1 AD患者外周血CD3+CD4+CD25+Treg的流式结果Figure 1 The results of flow cytometry about CD3+CD4+CD25+Treg in peripheral blood of AD patients

3 讨论

特应性皮炎是一种复发性的以严重瘙痒为主要临床表现的慢性过敏性皮肤病，其病因复杂，涉及多个方面，免疫和变态反应是其中两个重要的方面。既往研究表明，Th细胞参与了特应性皮炎的发病［11］。Th细胞是根据功能分类的T细胞亚群，对机体的特异性免疫和非特异性免疫均具有重要调节作用。据其分泌细胞因子的不同可分为Th1、Th2、Th17、Treg等亚型。IFN-γ、IL-4分别是Th1、Th2细胞的特征性细胞因子［12］。Th17和Treg 是Th细胞的两个新亚型，是目前研究的热点。它们在免疫应答、自身免疫性疾病的发生中发挥着重要的意义。既往研究发现，在特应性皮炎患者中，存在Th1/Th2［3］及Th17/Treg［13］的失衡。

SLIT是一种安全、有效的免疫治疗方法［14-15］。在我国，标准化的尘螨变应原疫苗粉尘螨滴剂也于2006年被CFDA批准上市，舌下含服粉尘螨滴剂在特应性皮炎中的安全性和有效性已被大量学者研究证实［5-7］，本研究结果同样显示SLIT组有效率明显高对于对照组。但是其有效性的免疫学机制尚不完全清楚。本研究中采用舌下含服粉尘螨滴剂，浓度从低到高逐渐增加进行特异性脱敏治疗，即通过抗原反复刺激机体从而增强机体对抗原的适应性，使机体产生免疫耐受，从而达到不发生或发生轻微过敏症状的目的。Allam［16］认为SLIT的作用机制可能是通过诱导调节性T细胞活化、调节Th1/Th2细胞亚群的平衡、诱导阻断性IgG4抗体产生并抑制IgE的合成来发挥免疫调节作用，从而使患者对特异性变应原产生长期耐受。本文研究发现，SLIT组治疗后IL-4、IL-17较治疗前明显下降，IFN-γ和Treg较治疗前明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。且SLIT组治疗后较对照组治疗后IL-4、IL-17下降更明显，IFN-γ升高更明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。Potter等［17］在变应性鼻炎患者中发现，经SLIT治疗后，能引起外周血IL-4水平下降和IFN-γ水平升高。SLIT治疗可能通过降低外周血Th2水平，升高Th1水平，使Th1/Th2平衡恢复，而达到治疗的目的。近几年国内外大量研究得出，在AD患者皮损中和外周血单核细胞中能检测到IL-17，并发现其水平与AD病情严重程度相关［18-19］，而同时检测AD患者血浆中Th17细胞的数量明显升高。本研究发现SLIT治疗后可使IL-17水平下降，与Tian等［20］在儿童哮喘患者中经SLIT治疗后对IL-17的影响结果一致。我们的前期研究中发现AD患者外周血中Treg数量下降参与了AD的发病［21］。本研究中SLIT组治疗后Treg细胞数量较对照组治疗后升高更多，但差异无统计学意义（P＞0.05），可能与样本量较小有关。Stelmaszczyk等［22］同样发现在患者特应性皮炎等过敏性疾病的儿童患者中，经变应原特异性免疫治疗后其Treg水平会升高。故在特应性皮炎患者中，舌下含服粉尘螨滴剂能降低其外周血IL-4、IL-17水平，升高IFN-γ和Treg水平，从而促进Th1/Th2、Treg/Th17平衡的恢复，而达到治疗的目的。

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The role on the T helper cells of sublingual immunotherapy for atopic dermatitis

ZENG Mei★，LI Qingxiang，HUANG Wenfu，CHEN Junzhao，LIU Jinhua，WANG Cuiyan
（Department of Dermatology，Huizhou municipal central Hospital，Huizhou，Guangdong，China，516000）

Objective To explore the role on the T helper cells（Th）in sublingual immunotherapy (SLIT)with standardized dermatophagoides farinae drops on patients with atopic dermatitis(AD). Methods Between the two AD groups before and after treatment:sublingual immunotherapy with standardized dermatophagoides farinae drops(SLIT group)and control one,serum concentrations of Th1（IFN-γ）、Th2(IL-4)、Th17（IL-17）were evaluated using enzyme-linked immuno sorbent assay(ELISA).The levels of CD4+CD25+Treg cells in peripheral blood were assessed by flow cytometry.Then the IFN-γ,IL-4,IL-17 and Treg levels were compared between the two groups before and after treatment,as well as between the groups after treatment with two independent samples t or corrected t(t')test. Results IL-17 and IL-4 in the SLIT group were significantly decreased after treatment versus before treatment,IFN-γ and Treg were significantly higher after treatment than before treatment as well,and the differences were significant(P＜0.05).Compared with the SLIT group and the control group after treatment,IL-17 and IL-4 decreased more significantly,IFN-γ increased more significantly,the difference was statistically significant(P＜0.05).After treatment,the number of Treg cells in SLIT group was higher than that in the control group,but the difference was not statistically significant(P＞0.05). Conclusion SLIT in patients with atopic dermatitis(AD)can reduce the level of IL-4,IL-17 in the peripheral blood and increase the level of IFN-γ and Treg,then finally achieve the purpose of treatment.

Atopic dermatitis;T helper cells;Dermatophagoides farinae drops;Regulatory T cells

惠州市中心人民医院皮肤科，广东，惠州516000

★通讯作者：曾美，E-mail：251872857@qq.com