GM1对脑出血大鼠LINGO-1表达的影响

梁顺利 张荣博* 吴忧 章水晶 徐彬

GM1对脑出血大鼠LINGO-1表达的影响

梁顺利 张荣博* 吴忧 章水晶 徐彬

目的观察脑出血后LINGO-1表达的变化，探讨GM1对脑出血后LINGO-1表达的影响。方法将72只SD大鼠随机分为假手术组、模型组和GM1治疗组，选取造模后1d、3d、7d和14d为观察点。制备脑出血模型，Longa评分法评价神经功能缺损程度，RT-PCR法检测LINGO-1 mRNA的表达，Western blot法检测LINGO-1蛋白的表达。结果模型组Longa 评分7d最高，14d出现下降；LONG-1 mRNA 3d表达最高，7~14d出现下降；LONG-1蛋白7d到达高峰，14d出现下降。GM1治疗组在14d Longa评分较模型组下降（P<0.05）；在7d和14d LINGO-1mRNA表达较模型组下降（P<0.05）；在14d LINGO-1蛋白表达较模型组下降（P<0.05）。结论脑出血后LINGO-1表达明显上调，呈先上升后下降的变化规律。GM1可以降低LINGO-1 mRNA和蛋白的表达及神经功能评分，这可能是GM1促进脑出血后神经功能恢复的机制之一。

LINGO-1 脑出血 神经节苷脂 神经再生

【Absract】 ObjectiveTo explore the effect of monosialotetrahexosy1 ganglioside on expressions of LINGO-1 in rats with intracerebral hemorrhage（ICH）.Methods72 SD rats were randomly divided into sham operation group，model group and monosialotetrahexosy1 ganglioside group. Observation was made at 1，3，7，14d after ICH. Neurological functional recovery was evaluated by Longa's score；RT-PCR and Western blot were applied to detect the changes in the expressions of LINGO-1 mRNA and protein.ResultsLonga's score and LINGO-1 protein were decreased at 14d after ICH in monosialotetrahexosy1 ganglioside group compared with those in model group（P<0.05）. The LINGO-1 mRNA was decreased at 7d and 14d after ICH in monosialotetrahexosy1 ganglioside group compared with model group（P<0.05）.Conclusions The decreased expressions of LINGO-1 and neurological score induced by monosialotetrahexosy1 ganglioside may be one of the mechanisms of neural function recovery after ICH.【Key words】LINGO-1 Intracerebral hemorrhage Monosialotetrahexosy1 ganglioside Nerve regeneration

脑出血（Intracerebral hemorrhage，ICH）是一种常见的神经系统疾病，最终导致持久的功能损害，其原因为中枢神经损伤后再生能力的缺乏。近年研究发现勿动蛋白（Nogo）与神经再生障碍有关，抑制Nogo或受体复合物可以促进轴突的生长［1］。赖氨酸重复序列和免疫球蛋白结构域（Leucine rich repeat and Ig domain containing1，Lingo-1）是Nogo受体复合物中的一种重要的跨膜蛋白，负向调节少突胶质细胞分化，轴突再生，髓鞘形成和神经元存活［2］。研究表明抑制LINGO-1的表达能延长神经轴突和改善神经功能。单唾液酸四己糖经节苷脂（Monosialotetra -hexosy1 ganglioside，GM1）是一种具有神经损伤修复作用的糖鞘脂，在急性神经损伤的研究中GM1能促进神经轴突的生长，促进神经功能恢复［3］，但GM1对ICH后LINGO-1的表达研究较少。本研究观察GM1对ICH后LINGO-1表达的影响，旨在探讨LINGO-1在ICH中的可能作用及GM1对ICH的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组 清洁级雄性成年SD大鼠72只，体重180~220g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。随机分为3组，即假手术组（n=24）、模型组（n=24）和GM1治疗组（n=24）。每组分为术后1d、3d、7d和14d四个小组，每小组各6只。

1.2 大鼠脑出血模型制备 参照Yang等［4］报道的方法：术前4 h禁食不禁水，称重后用10%水合氯醛按350mg/kg腹腔麻醉，俯仰立体定向仪上并同时固定，用微量注射器从大鼠近尾段的尾动脉抽取50μl新鲜不凝血，在立体定向仪引导下按20μl/min的速度缓慢匀速注入左侧尾状核（前囟前0.2mm，左侧中线旁开3mm，深度5mm）。注血结束后留针15min等血液凝固后缓慢拔针，保温至苏醒后分笼喂养。假手术组在相同部位缓慢注入50μl生理盐水，其余步骤同上。治疗组造模成功后腹腔注射GMI，每只大鼠每天30mg/（kg·d），连用14d；模型组每只大鼠腹腔注射生理盐水30mg/（kg·d）；假手术组术后不做任何处理。

1.3 LINGO-1 mRNA检测 采用RT-PCR法检测：脑组织取自出血灶周，所得RNA用紫外线分光光度计定量测量RNA浓度。逆转录合成cDNA：反应体积10μl，37℃孵育15min，85℃，5s终止反应，灭活反转录酶。引物序列如下：LINGO-1 引物序列为上游5-GCCACCTGGTCTATCT CCGTTTC-3'，下游5-GCAGGTAATTGAGCCCACGAAA G-3'（162 bp）。内参ACTIN 上游5'-CG TTGACATCCGTAAAGACCTC-3'，下游5'-TAGGAGC CAGGGCAGTAATCT -3'（110 bp），均由武汉谷歌生物有限公司设计合成。反应条件：94℃预变性3min，进入循环94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸5min。RT-PCR 产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳条带用美国Quantity-one凝胶图像处理系统分析，计算目的条带和内参照吸光度比值。

1.4 LINGO-1蛋白检测 采用Western blot法检测：出血灶周脑组织在PBS中匀浆，离心，加入裂解液后置于冰上不断搅拌，后于4℃离心8min，上清液用3倍缓冲液稀释，100℃煮5min制样，用于SDS-PAGE。将胶上的蛋白转移至PVDF膜，用1% 酪蛋白封闭液封闭膜1h，在0.5%封闭液稀释的一抗中4℃过夜。洗膜后在HRP标记的二抗摇床孵育2h，漂洗后在化学发光溶液中显色，用ChemiDoc XPS 系统扫描，用Image Lab 4.0图像软件测量LINGO-1蛋白和β-actin蛋白各显色条带的平均光密度比值。

1.5 神经功能评分 参考 Longa等［5］评分标准：在造模成功后1d、3d、7d、14d分别对各组大鼠进行神经功能评分。0分：无神经缺损症状。1分：提尾悬空时对侧前肢呈屈曲，不能完全伸展。2分：行走时向对侧转圈。3分：站立时向对侧倾倒。4分：不能自行行走，意识下降。0分和4分大鼠不纳入实验。

1.6 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。计量资料以（±s）表示，统计方法采用单因素方差分析，组间比较方差齐者用LSD法，GM1治疗组各时间点对LINGO-1蛋白表达与Longa评分进行Pearson相关性分析，用r值表示相关系数，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能Longa评分 假手术组Longa评分均低，各时间点比较差异无统计学意义（P>0.05）；模型组与假手术组比较，各时间点Longa评分均增高，差异均有统计学意义（P<0.05），且7d时间点表达量最高，14d出现下降；GM1治疗组与模型组比较，在1d、3d、7d时间点，Longa评分差异无统计学意义（P>0.05），在14d时间点，Longa评分下降明显，差异有统计学意义（P<0.05），提示14d GM1治疗组较模型组神经功能恢复程度较好。见表1。

表1 各组大鼠神经功能Longa评分比较［分，（x±s）］

2.2 LINGO-1 mRNA 表达变化 假手术组LINGO-1 mRNA仅少量表达，各时间点比较差异无统计学意义（P>0.05）；模型组1d、3d、7d及14d LINGO-1 mRNA表达与假手术组比较均明显升高（P<0.05），3d时间点表达最高，7~14d 表达呈下降趋势；GM1治疗组LINGO-1 mRNA表达，在1d和3d时间点与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05），在7d和14d 时间点较模型组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠LINGO-1 mRNA表达比较（x±s）

2.3 LINGO-1蛋白表达变化 假手术组LINGO-1蛋白表达量少，各时间点比较差异无统计学意义（P>0.05）；模型组1d、3d、7d及14d LINGO-1蛋白表达与假手术组比较均明显升高（P<0.05），且在7d达高峰，14d出现下降；GM1治疗组LINGO-1蛋白表达，在1d和3d时间点与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05），在7d和14d 时间点较模型组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 各组大鼠LINGO-1 蛋白表达比较（x±s）

2.4 Pearson相关性分析 GM1治疗组LINGO-1蛋白表达水平在各时间点与神经功能Longa评分进行Pearson相关性分析，结果显示0

3 讨论

ICH是常见脑血管疾病，中枢系统损伤导致神经轴突不能再生，最终神经功能障碍遗留后遗症。而神经轴突的再生与髓鞘相关抑制因子有关。研究表明［6］：髓鞘相关抑制因子与勿动蛋白受体（Nogo receptor，NgR）复合物相结合，激活RhoA激酶，使细胞骨架发生动力学改变，进而引起神经轴突的生长锥溃变，从而抑制轴突再生和延长。进一步研究表明［7］：LINGO-1是连接髓鞘抑制信号与NgR复合物的纽带。LINGO-1为中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）专有蛋白，高度表达于CNS神经元和少突胶质细胞。LINGO -1的主要功能有以下几个方面［8］：（1）抑制轴突再生。（2）抑制少突胶质细胞分化和髓鞘形成。（3）抑制神经元存活。在缺血性卒中LINGO-1表达上调，而在出血性卒中，LINGO-1表达是否上调仍不清楚。本研究结果显示ICH后LINGO-1 mRNA表达于1d开始增加，3d 到达高峰，7d开始下降，14d 进一步下降。3d前的上升考虑为出血性脑损伤后神经元的应激反应及炎性因子的刺激所致，7~14d下降考虑为血肿的吸收期，应激和炎性因子刺激减少，LINGO-1 mRNA相应降低。相对应的LINGO-1 蛋白表达于1d开始增加，7d到达高峰，14d逐渐下降。总之，在出血周边区，LINGO-1的表达随血肿的出现上升，随血肿的吸收出现下降，但仍高于假手术组。推测ICH早期尤其是3~7d LINGO-1高水平维持可能是ICH后神经再生障碍的原因之一。

GM1是一种糖鞘脂，参与神经元的生长﹑分化和表型的表达以及细胞迁移和神经生长锥的定向延伸，具有神经保护和神经修复双重作用［9］。在卒中的研究中使用GM1能有效改善预后，但研究仍集中在以前的作用机制上［10-11］：（1）保护细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca+-Mg+-ATP酶活性。（2）阻止Ca+内流。（3）降低兴奋性氨基酸的神经毒性。（4）抑制细胞凋亡等。对于GM1直接作用于细胞膜发挥神经再生研究较少，谭学新等［12］利用外源性GM1治疗兔面神经损伤，结果显示有髓神经纤维数量﹑髓鞘厚度﹑轴突直径﹑神经传导速度均明显高于对照组。本实验从神经轴突再生角度，研究GM1对轴突再生抑制通路的LINGO-1表达的影响。研究结果显示：与模型组比较，GM1治疗组神经功能Longa评分在14d出现明显下降（P<0.05），LINGO-1 mRNA的表达在7d和14d出现明显下降（P<0.05），LINGO-1蛋白的表达亦在7d和14d出现明显下降（P<0.05），且LINGO-1蛋白水平与Longa评分行相关性分析示两者强相关。提示GM1治疗作用可能是通过抑制LINGO-1mRNA和蛋白的表达，抑制RhoA激活，减少RhoA激酶的活化，促进脑出血周围神经轴突的再生和延长，进而促进神经功能的改善，为GM1在ICH中的应用提供了依据。

［1］ Wang Y, Gu J, Feng X, Wang H, et al. Effects of Nogo-A receptor antagonist on the regulation of Wnt signaling pathway and neural cell proliferation in newborn rats with hypoxic ischemic encephalopathy. Mol Med Rep, 2013, 8(3):883-886.

［2］ Andrews JL, Femandez-Enright F. A decade from discovery to therapy:Lingo-1, the dark horse in neurological and psychiatric disorders. Neurosci Biobehav Rev, 2015, 56:97-114.

［3］ Wang Q, Song YH, Tang Z, et al. Effects of ganglioside GM1 and neural growth factor on neural stem cell proliferation and differentiation. Genet Mol Res, 2016, 15(3):362-368.

［4］ Yang GY, Betz AL, Chenevert TL, et al. Experimental intracerebral hemorrhage relationship between brain edema, blood flow and blood brain barrier permeability in rats. J Neurosurg, 1994, 81:93-102.

［5］ Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989, 20: 84-91.

［6］ Kempf A, Schwab ME. Nogo-A represses anatomical and synaptic plasticity in the central nervous system. Physiology, 2013, 28(3): 151-163.

［7］ Cen J, Wu H, Wang J, et al. Local injection of lentivirus encoding LINGO-1-sh RNA promotes functional recovery in rats with complete spinal cord transaction. Spine, 2013, 38(19):1632-1639.

［8］ Zhang Y, Zhang YP, Pepinsky B, et al. Inhibition of LINGO-1 promotes functional recovery after experimental spinal cord demyelination. Exp Neurol, 2015, 266:68-73.

［9］ Schnaar RL. Gangliosides of the Vertebrate Nervous System. J Mol Biol, 2016, 428(16):3325-3336.

［10］ Li L, Tian J, Long MK, et al. Protection against Experimental Stroke by Ganglioside GM1 Is Associated with the Inhibition of Autophagy. PLoS One, 2016, 11(1):684-686.

［11］ Zhang J, Fang X, Zhou Y, et al. The Possible Damaged Mechanism and the Preventive Effect of Monosialotetrahexosylganglioside in a Rat Model of Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury. J Stroke Cerebrovasc Dis, 2015, 24(7):1471-1478.

［12］ 谭学新, 张继东, 王玉新. 外源性神经节苷脂GM1对面神经再生的影响. 中国医科大学学报, 2003, 32(6):528-529, 536.

浙江省医药卫生科研项目（201464439）

310005 浙江中医药大学附属第二医院

*通信作者