干酪乳杆菌抗热保护剂的Plackett-Burman试验研究

陈 合， 寇建波， 杨 妍， 张 萍， 舒国伟

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)



干酪乳杆菌抗热保护剂的Plackett-Burman试验研究

陈 合， 寇建波， 杨 妍， 张 萍， 舒国伟

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

益生菌是功能性食品的主要功能因子，干酪乳杆菌L61具有较强的产抗氧化肽的能力.选取6种抗热保护剂，采用Plackett-Burman试验研究其干酪乳杆菌L61的抗热性能，以提高喷雾干燥制备干酪乳杆菌奶粉中的活菌数及抗氧化性.结果表明：甘油、脱脂乳和葡萄糖对干酪乳杆菌L61存活率影响最为显著，优化确定了 3种物质作为干酪乳杆菌抗热保护剂的最适添加量，即脱脂乳18 g/L、葡萄糖6%、甘油13 mL/L，为喷雾干燥制备高活性干酪乳杆菌奶粉提供了技术依据.

抗热保护剂； 干酪乳杆菌L61； 羊奶粉； 抗氧化

0 引言

益生菌是维护人体健康的重要功能因子[1].干酪乳杆菌作为益生菌的一种，进入人体后可在肠道内存活，调节肠内菌群平衡、促进肠道消化吸收[2]、具有降胆固醇、增强免疫及预防癌症和抑制肿瘤生长等保健作用[3,4].已广泛应用于功能性食品中，特别是乳制品的开发.

自20世纪50年代Harman提出了自由基学说(free radical theory)以来，人们逐渐认识到人体内氧化产生的自由基与其衰老及许多疾病有关.因此，具有清除自由基和抑制脂质过氧化功能的抗氧化剂成为研究的热点，乳源抗氧化肽等天然抗氧化肽更是引起人们的关注[5-7].

目前乳源抗氧化肽主要采用酶解蛋白制备，发酵乳蛋白制备抗氧化肽的文献不多，而关于抗氧化的益生菌产品、特别是含有产抗氧化肽的益生菌奶粉少有报道.课题组在前期从25株益生菌中筛选出四株发酵羊乳产抗氧化肽能力较强的乳杆菌[8]，并对干酪乳杆菌L61发酵羊乳产抗氧化肽的工艺条件进行了优化.本研究在此基础上，以含抗氧化肽的益生菌发酵羊乳为原料，采用喷雾干燥制备干酪乳杆菌L61抗氧化益生菌羊奶粉，研究筛选抗热保护剂，以改变在喷雾干燥过程中的物理、化学环境，减轻高温对细胞损害，提高干酪乳杆菌的存活率[9,10]，为后续抗氧化益生菌羊奶粉的中试及产业化提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

(1)主要材料：干酪乳杆菌L61，陕西科技大学食品与生物工程学院；脱脂羊乳粉，富平县秦源乳业有限公司； DPPH，Sigma公司；甘油、脱脂乳粉、葡萄糖等，均为食品级；MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基，均为北京陆桥技术股份有限公司；复原乳培养基，蒸馏水将脱脂羊乳粉配制为11%(w/v)的复原羊乳，105 ℃灭菌15 min.

(2)主要仪器：YX.280D手提式压力蒸汽灭菌锅，江阴滨江医疗器械厂；FA2004B电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；LG10-2.4型离心机，北京医用离心机厂；FJ-200高速分散均质机，上海索映仪器设备有限公司；DH5000AB电热恒温培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；DK.98.1型电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；pHs-3C型pH计，上海精科仪器公司；SW-CJ-IF无菌操作台，苏州江东精密仪器有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

将冷冻保存的干酪乳杆菌L61菌粉接种于已灭菌冷却的MRS肉汤培养基中，充分混匀后于37 ℃恒温培养箱中培养24 h得到一代活化液，再取上述活化液按5%(v/v)接种于MRS肉汤培养基中于37 ℃培养24 h得到二代活化液，如此重复活化三代，第三代培养时间为18 h.

将上述获得的第三代活化液按5%接入11%(w/v)复原脱脂羊乳培养基中，混匀后于37 ℃恒温培养箱中培养至凝乳后置于4 ℃冰箱备用.

1.2.2 发酵乳制备

将11%复原脱脂羊乳于105 ℃灭菌15 min，待其冷却后按5%接种量接入已活化菌种，置于41 ℃恒温水浴发酵16 h后取出，得到含抗氧化肽的干酪乳杆菌发酵乳.

1.2.3 抗热保护剂筛选

在干酪乳杆菌发酵乳中加入不同保护剂并于75 ℃恒温水浴中保温10 min.测定保温前后活菌数并计算存活率.

1.2.4 检测方法

(1)活菌数测定

按照GB 4789.35-2010，采用稀释涂布平板计数法，每一样品选取三个稀释梯度，每一梯度做三个平行实验以求得平均值.

(2)酸度测定

采用氢氧化钠滴定法[11].取5 mL发酵液注入容量为150 mL的三角瓶中，加入45 mL蒸馏水稀释，加入2～3滴1%酚酞指示剂，用0.l mol/L NaOH标准溶液滴定，不断轻微摇动三角瓶，直至微红色在30秒内不消失为止，即为滴定终点.将滴定时消耗的0.1 mol/L NaOH标准溶液的毫升数乘以20，即为100 mL发酵液的滴定酸度(°T).

(3)pH测定

室温下用pHs-3c测定.

(4)抗氧化性测定

发酵羊乳乳清样品制备：将发酵乳充分震荡摇匀并倒入烧杯中，测定pH.先用1 mol/L的盐酸溶液调节发酵乳pH至3.4～3.6，5 000 r/min离心15 min，取上清液；将上清液再用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8.3后，5 000 r/min离心15 min，取上清液，此上清液即为用于测定抗氧化性的待测样品溶液[12].

羟自由基清除率表示抗氧化性大小.采用紫外分光光度计，分别移取2 mL待测样品溶液、2 mL硫酸亚铁溶液(9 mmol/L)和2 mL过氧化氢溶液(10 mmol/L)注入到10 mL的试管中充分震荡混合，37 ℃ 孵育10 min，加入2 mL水杨酸溶液(9 mmol/L)，混匀后37 ℃孵育30 min，于510 nm 处测定混合溶液的吸光度，每组三个平行，求平均值.纯水做空白对照组[13].

清除率=(1-对照组/试验组) ×100%

2 结果与讨论

2.1 Plackett- Burman试验结果分析

选取蔗糖(X2)、脱脂乳粉(X3)、葡萄糖(X4)、海藻糖(X6)、明胶(X8)、甘油(X9)等六种常见保护剂，设计高低水平(1和-1)P-B试验.各个因素水平编码如表1所示，P-B试验结果如表2所示.其中X2、X4、X6 及X8为质量分数(%)，X3为质量体积分数(g/L)，X9为体积分数(mL/L)；响应值Y1为菌体存活率(%)，Y2为羟基自由基清除率(%)，Y3为酸度(°T)，Y4为 pH值.不加保护剂作为对照组，存活率为0.68%.

表1 抗热保护剂P-B筛选编码表

表2 抗热保护剂P-B试验设计及结果

随着羊乳发酵的进行，产酸增多，其pH值和酸度有所变化，但均在正常范围内，表明发酵性能良好.其各因子对响应值Y1的置信区间如图1所示，显著效应如图2所示.对响应值Y2的置信区间如图3所示，显著效应如图4所示.

图1 各因子对于菌体存活率的置信区间

由图1可知， X9对于响应值Y1的影响呈正效应，即菌体存活率随着因子添加量的增加而增大；因子X2、X3、X4对于响应值Y1的影响呈现负效应，即菌体存活率随着因子添加量的增加而减小；因子X8、 X6对响应值Y1几乎无影响.其中X1、X5、X7为虚拟项，用于消除试验中误差.

由图2可以看出，因子X3对响应值Y1的影响效果最明显，并且各个因子对于菌体存活率的影响显著性效果先后顺序为：X4(葡萄糖)>X3(脱脂乳)>X9(甘油)>X2(蔗糖)>X6(海藻糖)>X8(明胶).P-B试验结果表明，影响菌体存活率较为突出的三个因子分别为脱脂乳、葡萄糖、甘油.

图2 各因子对于菌体存活率的显著性效应图

由图3可知，因子X2、X3、X9对发酵羊乳抗氧化性的影响呈现正效应，即响应值Y2随各因子添加量的增加而增大；而其余因子X4、X6、X8对于抗氧化性呈现负效应关系，即抗氧化性随着因子添加量的增加而减小.其中X1、X5、X7为虚拟项.

图3 各因子对抗氧化性的置信区间

从图4可以看出，X6对响应值Y2的影响最为显著，各因子对发酵羊乳抗氧化性的显著性依次为：X6(海藻糖)>X3(脱脂乳)>X4(葡萄糖)>X9(甘油)>X8(明胶)>X2(蔗糖).

图4 各因子对抗氧化性的显著性效应图

2.2 验证试验及结果分析

各因子对发酵羊乳抗氧化性和菌体存活率结果不完全一致，因此进行验证试验.其中，a表示在发酵乳中添加脱脂乳、葡萄糖和海藻糖；b表示在发酵乳中添加脱脂乳、葡萄糖和甘油.其结果如表3所示.

表3 对比试验设计及结果

本研究目的主要在于研究菌体保护剂，最大可能的提高菌体存活率，为后续工厂化采用喷雾干燥法制备益生菌羊奶粉筛选抗热保护剂.同时，由表3可知，海藻糖与甘油对于发酵羊乳抗氧化性结果差异不是很大.因此，综合分析考虑最终选取葡萄糖、脱脂乳、甘油三个因子的爬坡试验.

2.3 爬坡试验设计及结果分析

基于上述结果确定葡萄糖、脱脂乳及甘油爬坡试验起点，选取合适的步长进行爬坡试验，确定后续响应面试验中心点.爬坡试验设计与结果如表4所示.

由表4可知，爬坡实验中，发酵羊乳pH值随着登高步数的增加先增后减；活菌数、存活率和抗氧化性随着登高步数的增加均呈现先增后减的趋势，当各因子添加量的取值在第二步时，菌体存活率及抗氧化性均达到最大值，即脱脂乳18 g/L、葡萄糖6%、甘油13 mL/L

表4 抗热保护剂爬坡试验设计及结果

2.4 糖、乳及甘油抗热保护剂分析

糖类保护剂生物作用目前有“水代替假说”和“玻璃态假说”两种学说[14,15].其中“水代替假说”认为糖的羟基可以代替蛋白质极性基团的周围水分子形成氢键，达到保护菌体的作用；而“玻璃态假说”认为糖-水混合物会发生玻璃化，保护剂包围在蛋白质周围，防止蛋白质变性.脱脂乳粉之所以可以起到良好的保护效果，是因为乳清蛋白在菌体细胞外可以形成一层蛋白膜，减少菌体胞壁破损引起细胞内物质外露[16].甘油进入菌体细胞以后，使得胞内溶质浓度增大，内外压力基本相等，从而有效的减缓了菌体因受热时细胞出现脱水的现象[17].

范娜等[18]研究采用响应面试验优化嗜酸乳杆菌和双歧杆菌混合菌体的抗热保护剂，结果表明，海藻糖、明胶和甘油均能够提高菌体的抗热存活率，并且三者之间存在交互作用.

3 结论

葡萄糖、脱脂乳和甘油均对干酪乳杆菌L61有较好的抗热保护作用，优化确定的抗热保护剂的最适添加量为脱脂乳18 g/L、葡萄糖6%、甘油13 mL/L时，抗热保护效果最佳，活菌数最高，为喷雾干燥制备高活性干酪乳杆菌奶粉提供了技术依据.

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【责任编辑：陈 佳】

Study on thermal protective agent ofLactobacilluscaseiby Plackett-Burman design

CHEN He, KOU Jian-bo, YANG Yan, ZHANG Ping, SHU Guo-wei

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Probiotics are the main functional factors of functional foods,andLactobacilluscaseiL61 has strong ability to produce antioxidant peptides.The effects of six kinds of heat-resistant protective agent on heat resistance ofLactobacilluscaseiL61 were investigated,and the viable cell number and antioxidant activity inLactobacilluscaseiL61 milk powder by spray drying were improved by Plackett-Burman design.The results showed that glycerol,skim milk and glucose had the most significant effect on survival ofLactobacilluscaseiL61.Therefore,these 3 substances were chosen as thermal protective agents ofLactobacilluscaseiL61,and the additive amount of the three kinds of protective agents was determined: skim milk 18 g/L,glucose 6%,glycerol 13 mL/L,which laid provided a technical basis for the preparation of high activityLactobacilluscaseimilk powder by spray drying.

thermal protective agent；LactobacilluscaseiL61； goat milk powder； antioxidant activity

2017-01-29

陕西省农业厅农业科技创新转化项目(NYKJ-2015-004)

陈 合(1956-)，男，陕西咸阳人，教授，研究方向：食品生物技术与工程、功能性乳制品

2096-398X(2017)04-0122-04

TS201.3

A