辣椒素对脑缺血再灌注大鼠的保护作用及机制探讨*

李群英何清华徐 露李 靖

（1.四川省遂宁市中心医院，四川 遂宁 629000；2.重庆医科大学，重庆 400016；3.重庆市合川区人民医院，重庆 401520）

·研究报告·

辣椒素对脑缺血再灌注大鼠的保护作用及机制探讨*

李群英1何清华1徐 露2李 靖3△

（1.四川省遂宁市中心医院，四川 遂宁 629000；2.重庆医科大学，重庆 400016；3.重庆市合川区人民医院，重庆 401520）

目的 观察辣椒素对脑缺血再灌注模型大鼠的影响并对其机制进行初步探讨。方法 将75只健康雄性SD大鼠随机分为5组：空白组、模型组、辣椒素高剂量组、辣椒素中剂量组和辣椒素低剂量组，每组15只。除空白组外，线栓法建立大鼠右脑缺血再灌注模型。辣椒素高、辣椒素中和辣椒素低剂量组分别灌胃辣椒素100、50、25 mg/（kg·d），其他两组灌胃相应剂量的CMC-Na溶液，连续7 d。随后进行神经功能学评分、干湿重法检测大鼠脑含水量、TUNEL法测定神经元的凋亡、Western blot法测定cleaved Caspase-3蛋白表达情况。结果 辣椒素高、辣椒素中和辣椒素低剂量组均显著降低了神经功能评分、脑含水量、神经元凋亡数量和cleaved Caspase-3蛋白的表达（P＜0.01）。结论 辣椒素对脑缺血再灌注有一定的保护作用，其机制可能与抑制cleaved Caspase-3蛋白的表达有关。

脑缺血再灌注 辣椒素 cleaved Caspase-3

脑缺血再灌注损伤是指脑缺血后发生细胞损伤，但恢复血供后损伤反而加重的现象。脑缺血再灌注损伤是3大致死疾病之一，其致残致死率逐年上升，严重危害着公众的健康。细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤发生的主要机制之一，如何抑制神经元的凋亡，是治疗药物开发的重要方向［1］。辣椒素（CAP）是辣椒中引起辣味的物质，分子式为C18H27NO3。药理学研究证实，辣椒素具有镇痛、调血脂、保护胃黏膜、抗癌等作用；研究发现，辣椒素能有效抑制缺血再灌注损伤的心肌细胞凋亡［2-3］。辣椒素在中枢神经系统中能否发挥抗细胞凋亡的作用目前尚无报道，因此本实验将观察辣椒素对脑缺血再灌注大鼠神经元凋亡的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年健康雄性SD大鼠75只，体质量（250±50）g，购自重庆医科大学实验动物中心，合格证编号：2007.0001，SPF级饲养条件。

1.2 药物与试剂 辣椒素购自成都曼斯特生物科技有限公司（批号20141012，纯度＞98%），将其溶于0.5%的CMC-Na溶液中，配制成50 mg/mL的混悬液。TUNEL试剂盒和cleaved Caspase-3抗体，购自Abcam公司。

1.3 模型制备 根据Longa的方法，建立脑缺血再灌注大鼠模型［4］。10%水合氯醛以350 mg/kg的剂量腹腔注射用以麻醉大鼠。将麻醉后的大鼠固定于鼠板上，于颈正中切开皮肤，分离出右侧颈内动脉（ICA）与颈外动脉（ECA），于Y型分枝下3 cm处结扎ECA，于ECA上剪一“V”型小口，再将长度为20 mm的鱼线经ECA插进ICA，深度约（18.50±0.50）mm，从而阻断MCA血供。缺血时间为2 h，2 h后再将鱼线轻轻拔出，实现再灌。建立好的脑缺血再灌注损伤大鼠模型经Longa的神经评分法评分，分数＞3分的纳入实验［4］。

1.4 分组与给药 75只健康成年雄性SD大鼠，分为空白组、模型组、辣椒素高剂量组、辣椒素中剂量组和辣椒素低剂量组，每组15只。空白组不进行任何手术处理，其余各组用线栓法制备脑缺血再灌注大鼠模型。辣椒素高、中和低剂量组分别灌胃100、50和25 mg/kg的辣椒素，空白及模型组灌胃相应剂量的CMC-Na溶液，每日1次。连续7 d。

1.5 观察指标 1）神经功能评分：各组大鼠于末次给药后，根据Longa 5分法对神经功能进行评分。无神经缺损，为0分；提鼠尾左前爪内收，且无法伸直，为1分；行走左倾，为2分；左旋转，为3分；昏迷或无法行走，为4分。2）脑含水量检测：脑含水量检测方法为干湿重法，每组抽取大鼠5只。经10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉，麻醉后断头取脑，去除嗅球、小脑与低位脑干，分离左右脑半球，迅速称质量，所得质量为湿质量。随后放入110℃电烤箱进行烘烤，时间为24 h，取出迅速称质量，所得质量为干质量。脑含水量（%）＝（湿质量-干质量）/湿质量×100%。3）TUNEL法检测神经元凋亡：每组抽取大鼠5只，用水合氯醛进行麻醉，再仰卧固定于鼠板，在胸腹处进行联合切口再暴露出心脏。右心耳剪一缺口，将灌注针从心尖插入左心室，先灌入500 mL生理盐水，冲干血液，再灌入4℃的40 g/L浓度的多聚甲醛缓冲液，固定。断头取脑，常规固定2 h，洗涤4 h，再梯度乙醇脱水，经二甲苯透明后，进行石蜡包埋，再切厚度为5 μm的切片。其余步骤严格按照TUNEL试剂盒的说明书步骤进行操作。光镜下观察，有棕黄色颗粒细胞核的细胞为阳性细胞，算作凋亡细胞。每张切片在400倍光镜下，选取海马CA1区独立的4个视野区，计算TUNEL阳性细胞数目，计算出TUNEL阳性细胞的平均数。4）cleaved Caspase-3蛋白表达的检测：每组随机选取5只大鼠，提取出脑组织蛋白。先以BCA法检测出蛋白含量，再将生理盐水稀释组织匀浆上清液至2000 μg/mL。加入4倍上样缓冲液，于沸水中进行5 min水浴，再于-40℃中储存备用。取得10 μL样品，进行SDS-PAGE电泳，恒压设为80 V，电泳时间为30 min，再设为120 V，至电泳结束，取下凝胶进行转膜。于200 mA下转膜1 h，再于室温下封闭液进行PVDF膜的封闭，过夜。剪下PVDF膜，加入1∶250cleaved Caspase-3、β-actin一抗，再在室温下孵育1 h，TBST漂洗3次，每次为5 min。随后加入1∶5000二抗，室温孵育45 min。TBST漂洗3次，5 min。ECL法显色，于暗室中曝光2 min，再显影定影。

1.6 统计学处理 应用SPSS20.0统计学软件。计量资料以（±s）表示，采用t检验。P＜0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较 见表1。结果示脑缺血再灌注后，模型组及辣椒素高、中、低剂量组动物均发生明显的神经功能损害。与模型组相比，辣椒素高、中和低剂量组的神经功能评分显著降低（P＜0.01）。

表1 各组神经功能评分及脑含水量比较（±s）

表1 各组神经功能评分及脑含水量比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.01。下同。

组 别 n 神经功能评分（分） 脑含水量（%）空白组 15 0.0±0.0 77.62±0.18模型组 15 3.67±0.51 83.47±0.47辣椒素高剂量组 15 2.32±0.31*80.22±0.33*辣椒素中剂量组 15 2.44±0.46*80.64±0.37*辣椒素低剂量组 15 2.36±0.43*80.75±0.40*

2.2 各组大鼠脑含水量检测结果比较 见表1。脑含水量结果表明，脑缺血再灌注后，模型组和辣椒素高、中、低剂量组动物的脑含水量均出现明显升高。与模型组相比，辣椒素高、中和低剂量组脑含水量显著下降（P＜0.01）。

2.3 各组大鼠TUNEL阳性细胞结果比较 见表2。TUNEL阳性细胞是细胞核内黄色颗粒的细胞。结果表明，脑缺血再灌注后，模型组和辣椒素高、中、低剂量组动物的阳性细胞数出现明显上升，与空白组有显著差异（P＜0.05）。与模型组比较，辣椒素高、中和低剂量组阳性细胞数明显下降（P＜0.01）。

表2 各组海马TUNEL阳性细胞数量及cleaved Caspase-3蛋白表达比较（±s）

表2 各组海马TUNEL阳性细胞数量及cleaved Caspase-3蛋白表达比较（±s）

组 别 n 阳性细胞数 cleaved Caspase-3蛋白表达量空白组 15 1.97±0.72 0.36±0.08模型组 15 10.63±2.98 0.89±0.07辣椒素高剂量组 15 4.25±1.26*0.52±0.05*辣椒素中剂量组 15 4.03±1.20*0.55±0.04*辣椒素低剂量组 15 3.79±1.15*0.61±0.06*

2.4 各组大鼠cleaved Caspase-3蛋白的表达比较见图1，表2。Western blot结果显示，与空白组相比，模型组、辣椒素高、中和低剂量组动物的cleaved Caspase-3蛋白表达均出现明显的升高。与模型组相比，辣椒素高、中和低剂量组cleaved Caspase-3蛋白表达显著下降（P＜0.01）。

图1 各组大鼠cleaved Caspase-3蛋白表达

3 讨 论

随着我国人口老龄化，脑血管疾病的发病率呈逐年上升趋势。脑缺血再灌注损伤在脑血管疾病中占有极大的比例，而目前临床上没有针对该损伤的有效药物，亟需开发出新的有效药［5］。辣椒（Capsicum annuum L.syn.c.frutescans）是属于茄科辣椒属植物，其主要辛辣成分为辣椒素，是含香草酰胺的生物碱［6］。目前，针对辣椒素的药理作用已经进行了很多研究，已发现辣椒素具有治疗消化性溃疡、预防心血管疾病、治疗咳嗽、感冒、抗癌等作用［7］。

脑缺血再灌注发生后，炎症、细胞凋亡、氧化应激、神经兴奋性毒性都会引起脑组织损伤。其中脑细胞发生的程序性死亡，即细胞凋亡，造成了一系列神经功能障碍［8］。Caspase家族是哺乳类动物凋亡的启动者和执行者。在Caspase家族中，有一种关键的酶，叫做Caspase-3，它是最关键的凋亡蛋白酶，是细胞凋亡的执行者［9-10］。前期研究表明，缺血缺氧损伤中引起神经元凋亡的主要通路就是由Caspase参与的信号级联反应［11］。正常情况下，Caspase-3以酶原的形式存在，在各组水解酶的作用下，其裂解后发生活化，活化的Caspase-3通过自催化，再次裂解为cleaved Caspase-3。cleaved Caspase-3是细胞凋亡早期阶段激活的关键蛋白酶，是目前已知的执行凋亡的最后因子［12-14］。cleaved Caspase-3使得DNA发生结构性断裂，从而使得细胞发生凋亡［15-16］。

通过建立脑缺血再灌注大鼠模型，我们发现辣椒素能能显著降低神经功能评分、脑含水量、神经元凋亡数量和cleaved Caspase-3蛋白的表达，说明辣椒素对脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用，其机制可能为通过抑制cleaved Caspase-3蛋白的表达，从而抑制神经元凋亡，减轻脑损伤。

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Effect of Capsaicin on the Rat Model of Cerebral Focal Ischemia with Reperfusion and its Mechanism

LI Qunying，HE Qinghua，XU Lu，et al.SuiNing City Central Hospital，Sichuan，Suining 629000，China.

Objective：To study the effects of capsaicin on rats of cerebral focal ischemia with reperfusion and its mechanism.Methods：75 SD rats were randomly divided into 5 groups：control group，model group，cap high dose，cap middle dose and cap low dose group with 15 rats in each group.The suture method was used to establish the model of MCAO-reperfusion except the control group.Cap high dose，cap middle dose and cap low dose group were given 100，50 and 25 mg/kg cap for consecutive 7 days.Neurological deficit was scored，brain water content was detected with dry-wet method，neuronal apoptosis was measured with TUNEL method and level of cleaved caspase-3 were detected with western blot method.Results：Neurological deficit testing scores，brain water content，neuronal apoptosis and the level of cleaved caspase-3 decreased significantly in cap high dose，cap middle dose and cap low dose group（P＜0.01）and the difference was statistically significant compared the control group.Conclusion：Capsaicin has a protective effect on the rats of cerebral focal ischemia with reperfusion，and its mechanism may be related to reducing the expression of cleaved Caspase-3 protein.

MCAO；Capsaicin；Cleaved Caspase-3

R285.5

A

1004-745X（2017）05-0797-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.05.013

2017-02-07）

重庆市科委基础与前沿项目（cstc2016jcyA0268）

△通信作者（电子邮箱：lijing1976@163.com）