GM6001对激素性股骨头坏死大鼠组织形态学与基因表达的影响

仝昭方，王庆志，唐洪涛，朱英杰，李光明，沙莎

(1.河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)髋部疾病研究治疗中心，河南洛阳471002；2.新乡医学院人体解剖学教研室，河南新乡453003)

·论著·

GM6001对激素性股骨头坏死大鼠组织形态学与基因表达的影响

仝昭方1，王庆志2，唐洪涛1，朱英杰1，李光明1，沙莎1

(1.河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)髋部疾病研究治疗中心，河南洛阳471002；2.新乡医学院人体解剖学教研室，河南新乡453003)

目的探讨静脉注射基质金属蛋白酶抑制剂GM6001对激素性股骨头坏死(SINFH)大鼠组织形态学与基因表达的影响。方法60只健康SD大鼠，经臀肌注射甲基泼尼松后制备激素性股骨头坏死模型，随机分为SINFH组、低剂量GM6001(GM6001-L)组和高剂量GM6001(GM6001-H)组，每组20只，GM6001-L组与GM6001-H组在造模同时经尾静脉注射50 mg/kg GM6001与100 mg/kg GM6001，1周1次，共计8周。另选取20只健康SD大鼠于臀肌注射等量生理盐水作为对照，经12周、20周后，观察SD大鼠股骨头形态学改变，以及过氧化氢酶体增殖物激活受体γ(PPAPγ)、11β-羟基类固醇脱氧酶(11β-HSD1)、Run相关转录因子2(Runx2)与CCAAT区/增强子结合蛋白α(C/EBPα)的变化。结果与对照组比较，造模组大鼠造模8周内的血清钙、磷水平降低；SINFH大鼠经GM6001治疗后8周内的血清钙、磷水平均显著升高，与SINFH组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，且GM6001-H组血清钙、磷水平均高于GM6001-L组，差异有统计学意义(P＜0.05)；造模组大鼠造模8周内的BALP、StrACP水平显著高于对照组，BGP、CT水平显著低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；GM6001-L组与GM6001-H组经治疗后8周内的BALP、StrACP水平均显著低于SINFH组，BGP、CT水平均显著高于SINFH组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；造模组大鼠造模8周内的股骨转子、股骨头的骨密度及股骨头成骨细胞计数均低于对照组，破骨细胞数高于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；GM6001-L组与GM6001-H组经治疗后8周内的股骨转子、股骨头的骨密度及股骨头成骨细胞计数均高于SINFH组，破骨细胞计数低于SINFH组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。应用GM6001治疗后，与SINFH组比较，PPAPγ、11β-HSD1、C/EBPα表达减少，Runx2表达升高，且随剂量增加，PPAPγ、11β-HSD1、C/EBPα下降明显，而Runx2上升明显，与对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论大鼠股骨头坏死改变可能与激素抑制成骨及成脂分化基因表达有关，与11β-HSD1表达关系密切，而GM6001能改善这种病理改变以及基因异常表达，具有良好的临床应用价值。

股骨头坏死；GM6001；组织形态学；基因表达

目前，临床应用糖皮质激素广泛，由于糖皮质激素为自身免疫系统抑制剂，容易造成一系列的并发症。激素性股骨头缺血性坏死(steroid-induced necroisis of femoral head，SINFH)是糖皮质激素使用过程中最为常见的并发症之一[1]。SINFH不仅加重患者身体疼痛感，还会导致患者的运动功能障碍，进一步发展可能造成终生残疾等症状。研究表明，SINFH患者常见基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)的异常升高，MMPs为一组依赖于金属离子，如钙离子、锌离子的蛋白水解酶家族，MMPs主要作用为降解细胞外基质，其与SINFH的发生密切相关[2]。研究表明，MMPs不仅参与了组织发育修复、炎症反应及肿瘤发生发展，还可以导致SINFH[3-5]。很多药物可通过抑制MMPs活性，从而发挥对SINFH的治疗作用[6]，作为基质金属蛋白酶抑制剂之一，GM6001可显著抑制MMPs的活性，达到缓解SINFH症状目的[7]。目前，关于GM6001抑制SINFH的机制研究较少。本研究通过观察不同实验组大鼠股骨头组织形态学改变以及基因表达情况，探讨GM6001对SINFH大鼠组织形态学及基因表达的影响。

1 资料与方法

1.1 实验材料甲基泼尼松(美国Pfizer公司)，GM6001(美国Chemicon公司)，过氧化氢酶体增殖物激活受体γ(PPAPγ)抗体、11β-羟基类固醇脱氧酶(11β-HSD1)抗体、Run相关转录因子2(Runx2)抗体、CCAAT区/增强子结合蛋白α(C/EBPα)抗体以及引物序列均购自北京博奥森生物技术有限公司，RNA检测试剂购自大连宝生物公司。SP试剂盒购自北京中杉生物有限公司，11β-HSD1、PPAPγ、Runx2、C/EBPα等引物序列购自上海生工生物有限公司，GAA购自北京中棉有限公司。

1.2 动物与分组选择60只健康SD大鼠，雌雄各半，经臀肌注射甲基泼尼松，以制备激素性股骨头缺血性坏死模型，具体操作为：大鼠两边臀大肌均交替注射，每次20 mg/kg，1周1次，共计8周。60只模型大鼠随机分为SINFH组、低剂量GM6001 (GM6001-L)组和高剂量GM6001(GM6001-H)组，每组20只，GM6001-L组和GM6001-H组在造模同时经尾静脉注射50 mg/kg GM6001与100 mg/kg GM6001，1周1次，共计8周。另选取20只健康SD大鼠作为对照组，臀肌注射等量生理盐水作为空白对照，所有大鼠肌注青霉素20万U/只，1次/周，有效预防感染。所有SD大鼠均购自上海斯莱克实验动物技术有限公司，均饲养于SPF级实验动物房，湿度控制在40%～70%，室温为22℃～25℃，昼夜照明交替时间为12 h。

1.3 血清钙、磷、骨代谢指标、骨密度检测每组SD大鼠5只，于造模后2周、5周、8周清晨空腹状态下心脏采血，每只取血5 mL，离心机上6 000 r/min离心10 min，取上清分离血清，-80℃冰箱冷冻备用，血清样本钙、磷含量经全自动生化仪检测。酶联免疫试剂盒检测骨碱性磷酸酶(BALP)、骨钙素(BGP)、降钙素(PCT)含量；采用比色法检测破骨细胞型抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)活性；上述5只大鼠经脱颈处死，取双侧股骨头备用，活体股骨头及股骨转子间骨密度采用双能X线骨密度测定仪。所有操作均遵守试剂盒或仪器相关操作说明。

1.4 股骨头形态学观察SD大鼠5只，取双侧股骨头，沿其冠状面正中切开，以4%多聚甲醛固定24 h，10%乙二胺四乙酸溶液中脱钙3周，梯度乙醇脱水，脱水12 h后石蜡包埋切片，做4 μm厚连续切片，常规苏木精-伊红染色后光镜下观察。每张切片随机选取5个100倍视野，用成像显影系统软件分析计算镜下骨小梁面积比值与骨髓腔内脂肪细胞面积比值。400倍镜下随机选取5个视野，计数视野内染色阳性细胞(成骨细胞或脂肪细胞)，判断标准：细胞质内出现棕黄色颗粒样染色为阳性染色，计算阳性细胞所占总细胞的百分比，汇总取平均值。

1.5 骨组织切片免疫组织化学法(SP法)骨组织切片经脱蜡、水化操作后进行内源性过氧化物酶阻断操作；并由高压煮沸以进行抗原修复，后续加BSA封闭液；并滴加11β-HSD1、PPAPγ、Runx2、C/EBPα一抗，4℃过夜孵育；山羊抗小鼠IgG，经彻底显色，由苏木素复染色，乙醇梯度脱水，洗透明后，经中性树胶封片保存。于镜下评估所有切片。每组随机抽取3张切片，由3名检验师评定。高倍显微镜(400×)下观察并计算股骨头内孔隙数目，骨小梁轮廓及分布。

1.6 股骨头11β-HSD1、PPAPγ、Runx2、C/EBPα表达的qRT-PCR检测股骨头组织经RNA抽提，mRNA的含量经紫外分光光度计测定。RNA逆转录，根据mRNA的含量，利用qRT-PCR法检测基因表达。具体步骤：取股骨头组织标本，去除软骨组织，经研钵研磨成粉，加入RNAiso Plus，经裂解液裂解5 min后，4℃离心，加0.2 mL氯仿，摇匀，在室温下静置5 min，在4℃条件下，以速度12 000 r/min离心处理15 min，取上清液加入75%乙醇清洗沉淀，在4℃条件下，以速度12 000 r/min离心处理5 min，丢弃上清液，保留沉淀组织，取细胞RNA样本进行逆转录处理，采用实时定量qRT-PCR技术，反应条件按试剂盒操作书进行，检测股骨头组织的PPAPγ、11β-HSD1、Runx2、C/EBPα基因表达情况。

1.7 统计学方法应用SPSS19.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，两两比较采用t检验，多组间计量数据比较采用单因素方差分析，均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠组织形态学应用GM6001后，与SINFH组比较，小鼠股骨小梁面积所占比值明显升高，骨髓腔内脂肪占面积比值明显下降，且随着治疗时间延长，骨小梁面积比值上升更为明显，骨髓腔内脂肪占面积比值下降更为明显，差异有统计学意义(P＜0.05)；但SINFH组、GM6001组骨小梁面积比值低于对照组，骨髓腔内脂肪占面积比值高于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 四组大鼠形态学比较

表1 四组大鼠形态学比较

注:与对照组比较，aP＜0.05；与SINFH组比较，bP＜0.05。

组别只数骨小梁面积比值骨髓腔内脂肪占面积比值对照组SINFH组GM6001-L周组GM6001-H周组F值P值20 20 20 20 58.34±5.26 48.21±3.43a53.19±4.24ab55.65±4.81ab12.136 7 0.001 20.65±1.23 26.54±2.86a24.22±1.14ab21.65±1.63ab8.594 3 0.007

2.2 四组大鼠血清钙磷水平比较与对照组比较，造模组大鼠造模8周的内血清钙磷水平降低；SINFH大鼠经GM6001治疗后8周内血清钙、磷水平均显著升高，与SINFH组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)；且GM6001-H组血清钙磷水平均高于GM6001-L组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 四组大鼠血清钙磷水平比较(mmol/L)

2.3 四组大鼠的血清骨代谢指标水平比较造模组大鼠造模8周内的BALP、StrACP水平显著高于对照组，BGP、CT水平显著低于对照组；GM6001-L组与GM6001-H组经治疗后8周内的BALP、StrACP水平均显著低于SINFH组，BGP、CT水平均显著高于SINFH组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

2.4 四组大鼠大鼠的股骨骨密度及股骨头细胞计数比较造模组大鼠造模8周内的股骨转子、股骨头的骨密度及股骨头成骨细胞计数均低于对照组，破骨细胞数高于对照组；GM6001-L组与GM6001-H组经治疗后8周内的股骨转子、股骨头的骨密度及股骨头成骨细胞计数均高于SINFH组，破骨细胞计数低于SINFH组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

2.5 四组大鼠基因表达应用GM6001治疗后，与SINFH组比较，PPAPγ、11β-HSD1、C/EBPα表达减少，Runx2表达升高，且随剂量增加，PPAPγ、11β-HSD1、C/EBPα下降明显，而Runx2上升明显，与对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表5。

表3 四组大鼠血清骨代谢指标及骨密度水平比较

表3 四组大鼠血清骨代谢指标及骨密度水平比较

注：与对照组比较，aP＜0.05；与SINFH组比较，bP＜0.05；与GM6001-L组比较，cP＜0.05。

组别对照组SINFH组GM6001-L组GM6001-H组F值P值CT(μg/L) 228.45±27.53 65.74±7.83a 120.33±18.84ab177.26±21.27abc25.816 3 0.000只数20 20 20 20 BALP(μg/L) 48.35±4.77 78.24±7.73a62.25±6.17ab57.24±5.22abc14.156 9 0.001 BGP(μg/L) 6.26±0.88 1.33±0.25a2.54±0.32ab4.75±0.37abc6.668 3 0.012 StrACP(U/mL) 34.95±4.57 111.68±8.94a99.63±7.22ab62.84±5.25abc22.671 8 0.000

表4 周四组大鼠骨细胞计数(x±s)

表5 四组大鼠基因表达分析(x-±s)

3 讨论

近年来，随着临床糖皮质激素的广泛应用，SINFH的发生率明显升高。有报道显示，患者由于长期大剂量服用糖皮质激素，导致骨细胞活性破坏，骨吸收加重，且影响成骨细胞的正常功能，从而引起SINFH的发生[8]。SINFH不仅影响患者的临床治疗效果，而且由于股骨修复过缓缓慢，一定程度上增加临床治疗难度。因此，应积极采取有效治疗措施以促进患者股骨头坏死区域组织的功能修复。

股骨头是髋关节的重要组成部分之一，对人体起着负重，活动，吸收震荡等作用。血中钙磷水平是衡量股骨头的重要指标之一，两者水平高低与骨吸收及骨重建密切相关，且其水平高低受多个因子的调控[9]。钙磷水平的高低受骨碱性磷酸酶、骨钙素、降钙素及破骨细胞型抗酒石酸酸性磷酸酶等影响。其中，骨碱性磷酸酶为机体提供无机磷以合成骨盐结晶，与骨矿化密切相关，可作为成骨细胞成熟的早期标志之一[10]。成骨细胞产生骨钙素，骨钙素变化较快，其水平升高有利于骨形成，可直接反应骨代谢水平[11]。破骨细胞型抗酒石酸酸性磷酸酶产生于破骨细胞，主要反应骨吸收[12]。GM6001为一种含羧基的二肽，是一种广谱金属蛋白酶抑制剂，被认为是目前人工合成MMPs抑制剂中最强的一种[13]。GM6001的作用机制是通过与MMPs分子中的底物识别部位结合，并在酶的活性中心与催化所需的锌离子络合，抑制酶的活化，从而直接抑制MMPs对胶原的破坏。本文SINFH大鼠出现严重骨功能异常及骨代谢紊乱，经GM6001治疗后，均得到有效改善，提示GM6001抑制MMP活性，可有效改善SINFH伴有的骨功能异常及骨代谢紊乱。另外，骨的主要成分之一为钙磷，两者可有效确保骨的力学强度，同时可维持体内矿物质平衡。本文GM6001可提高SINFH大鼠的血清钙磷水平，有效促进新骨形成。本文SINFH大鼠经GM6001处理后，其股骨骨密度显著升高，与GM6001改善SINFH的结论相符。另外，SINFH的最早期病理变化为成骨细胞凋亡与破骨细胞激活[14]。本文GM6001可促进SINFH大鼠股骨细胞成骨细胞的生长并抑制破骨细胞的活化。

近年，研究表明，MMPs可参与骨细胞外基质的降解[3]。因此，采用GM6001治疗SINFH具有一定可行性。报道显示，经使用糖皮质激素后，机体细胞外基质大量聚集，骨髓脂肪细胞体积增大，骨小梁稀疏，局部骨量下降，最终发展为骨坏死[15]。本文对激素性股骨头坏死大鼠经GM6001处理后，结果发现，随着应用时间的延长，骨小梁面积比值明显升高，骨髓腔内脂肪占面积比值明显下降。提示GM6001在SINFH治疗方面具有一定的积极作用。11β-HSD1基因是内源性糖皮质激素的最重要调节酶，主要存在于成骨细胞及脂肪细胞的胞浆内，当存在外源性激素作用时间，会诱发11β-HSD1基因表达，同时也会引起PPAPγ、C/EBPα基因表达、Runx2基因减少。其中PPAPγ多存在于骨髓脂肪细胞的细胞质内，具有促进脂肪分化的作用，应用激素后，随着时间延长，PPAPγ表达增加[16]。C/EBPα多存在于骨髓成骨细胞及脂肪细胞的细胞质及细胞核内，使用糖皮质激素后，随着时间延长，其阳性细胞比例数升高，即C/EBPα表达增加。Runx2多存在于成骨细胞核及细胞浆内，其中以细胞浆表达为主，具有控制成骨细胞骨钙素、骨保护素等特异性基因的表达，使用激素后，其染色阳性成骨细胞数量明显减少，即C/EBPα表达减少[17]。本文SD大鼠经GM6001处理后，随着时间延长，PAPγ、C/EBPα、11β-HSD1基因表达减少，Runx2升高，与文献报道结果相符[5]。提示GM6001在SINFH基因表达调控方面发挥作用。

综上所述，GM6001具有改变SINFH组织学形态以及调节基因表达的作用，其能促进股骨成骨细胞的生长。由于本研究条件限制，关于GM6001在改善SINFH组织学形态及基因表达方面的具体作用机制，还需作进一步分析研究。

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Effects of GM6001 on histomorphology and gene expression in rats with steroid-induced necrosis of femoralhead.

TONG Zhao-fang1,WANG Qing-zhi2,TANG Hong-tao1,ZHU Ying-jie1,LI Guang-ming1,SHA Sha1.1.Center of Hip Disease Research and Treatment,Luoyang Orthopedic Hospital of Henan Province(Orthopedic Hospital of Henan Province),Luoyang 471002,Henan,CHINA;2.Department of Anatomy,Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003, Henan,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of GM6001 on histomorphology and gene expression in rats with steroid-induced necroisis of femoral head(SINFH).MethodsA total of 60 healthy SD rats were intragluteally injected with methylprednisolone for the preparation model of avascular necrosis of femoral head,which were randomly divided into the SINFH group,GM6001 low dose group(GM6001-L)and high dose group(GM6001-H)with 20 rats in each group.In GM6001-L group and GM6001-H group,the rats were intravenous injected with GM6001 by 50 mg/kg and 100 mg/kg respectively,1 time per week,for 8 weeks.At the same time,20 healthy SD rats injected with saline were taken as the blank control group.After 12 weeks and 20 weeks,the morphological changes of femoral head in SD rats,and the expression changes of peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ),11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1(11β-HSD1),runt-related transcription factor-2(Runx2),CCAAT/enhancer binding protein-α(C/EBPα) were observed.ResultsCompared with the control group,the serum calcium and phosphorus levels in the model group were decreased within 8 weeks.The levels of serum calcium and phosphorus in SINFH rats treated with GM6001 were significantly higher than those in SINFH group(P＜0.05),and the levels in GM6001-H group were significantly higher than those in GM6001-L group(P＜0.05).The levels of BALP and StrACP in the model group were significantly higherthan those in the control group within 8 weeks(P＜0.05),while the levels of BGP and CT were significantly lower than those in the control group(P＜0.05).The levels of BALP and StrACP in GM6001-L group and GM6001-H group were significantly lower than those in SINFH group(P＜0.05),while BGP,CT levels were significantly higher(P＜0.05).Compared with the control group,the femur and femoral head bone density and femoral head bone cell counts in the model group rats within 8 weeks were significantly decreased,and the osteoclast significantly increased(P＜0.05);Compared with the SINFH group,the femur and femoral head bone density and femoral head bone cell counts in GM6001-L and GM6001-H group rats after 8 weeks were significantly increased,and the osteoclast significantly decreased(P＜0.05). With the increase dose of GM6001 treatment,compared with the SINFH group,the expression of PPARγ,11β-HSD1,C/ EBPα significantly decreased,while Runx2 significantly increased(P＜0.05).ConclusionNecroisis of femoral head in rats may be closely related to the expression of hormone inhibiting osteogenic and adipogenic differentiation related gene and 11β-HSD1.GM6001 can improve the pathological changes and abnormal gene expression,which has the good clinical value.

Avascular necrosis of the femoral head;GM6001;Histomorphology;Gene expression

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.001

R-332

A

1003—6350（2017）15—2409—05

2017-03-20)

河南省教育厅科学技术研究重点项目(编号：142182310068)

仝昭方。E-mail：tfcgd5@163.com