EGFR基因突变与肿瘤标志物表达的关联性及其对原发性肺癌的诊断价值

邹传伟，王小拍，周丽霞

(广州市第一人民医院普通内科1、病理科2、心胸外科3，广东广州510000)

EGFR基因突变与肿瘤标志物表达的关联性及其对原发性肺癌的诊断价值

邹传伟1，王小拍2，周丽霞3

(广州市第一人民医院普通内科1、病理科2、心胸外科3，广东广州510000)

目的探讨原发性肺癌患者EGFR基因突变及系列肿瘤标志物表达状况，为肺癌的预防、预测、诊断和治疗提供依据。方法选择2014年3月至2015年12月期间广州市第一人民医院收治的160例原发性肺癌患者，取新鲜病理组织标本，用厦门艾德核酸提取试剂提取体细胞DNA，采用扩增阻滞突变系统荧光PCR(ARMS-PCR)技术检测EGER基因突变，采取外周静脉血用化学发光法检测血清系列肿瘤标志物，进行统计学分析。结果160例肺癌患者中，EGER基因野生型比率为47.56%(78/164)，EGER基因突变型比率为52.44%(86/164)，突变型中21L858R点突变占23.17%(38/164)，19Del突变占22.56%(37/164)。所检测肿瘤标志物按阳性率高低排序为：CYFRA21-1(351/537，65.36%)、CEA(346/532，65.04%)、CA125(203/361，56.23%)、CA153(137/358，38.27%)、CA724(116/365，31.78%)、CA199(71/366，19.40%)、NSE(84/536，15.67%)、SCC(47/535，8.79%)、AFP(31/364，8.52%)。EGER基因21L858R突变肺癌患者较19Del突变肺癌患者肿瘤标志物CEA阳性率高(71.97%和64.86%)，但差异无统计学意义(P＞0.05)；随着CEA浓度梯度递增，EGER基因突变率也递增。结论肺癌致病与EGER基因突变、肿瘤标志物高表达关系密切，通过系列肿瘤标志物和EGER基因突变检测，将有助于肺癌的诊断和鉴别诊断，并为肺癌治疗手段选择提供依据。

肺恶性肿瘤；EGFR基因；基因突变；肿瘤标志物

肺癌长期来位居国内恶性肿瘤发病率和死因构成中的首位，肺癌是严重影响国人健康、威胁生命的恶性疾病[1]。长期的实践经验已经证明，肺癌与工业排污、大气污染、吸烟相关联。抑制以上有害因素影响，并研究与肺癌致病相关影响因素，以加强肺癌的预防、预测、早期诊断和治疗，已引起社会各界高度关注与重视。本研究以160例原发性肺癌患者为样本，通过手术切除或纤支境等活检技术获取新鲜病理组织标本，并经病理组织细胞形态和免疫组化诊断技术确诊为肺癌，然后采用肺癌新鲜病理组织提取体细胞DNA，使用扩增阻滞突变系统荧光PCR(ARMS-PCR)法，对160例标本行EGER基因突变检测，并采取外周静脉血用化学发光法检测系列肿瘤标志物，从基因组学和蛋白质组学角度对肺癌致病进行研究，旨在探讨肺癌患者中EGER基因突变情况、以及其与系列肿瘤标志物表达的关系，为肺癌的预防、预测、诊断和治疗提供依据，现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料160例原发性肺癌患者来自2014年3月至2015年12月共22个月期间在广州市第一人民医院呼吸科、心胸外科、肿瘤科住院的患者，其中男性89例，女性71例；年龄35～86岁，平均(62.12± 1.82)岁。所有患者均根据临床症状和影像学检查(包括胸部X光照片和胸部CT)作出肺癌初步临床诊断。

1.2 研究方法

1.2.1 检测仪器设备EGER基因突变检测仪器使用美国ABI公司生产的ABI7500PCR仪，DNA提取试剂(型号：FFPE DNA,Cat NO.ADx-FF01)和人类EGER基因突变荧光PCR检测试剂盒由厦门艾德医学检验所提供。测定提取样本DNA浓度和纯度的紫外分光光度计型号Nanodrop2000。肿瘤标志物系列检测采用化学发光法，检测仪器使用德国罗氏Cobas e 602分析仪。

1.2.2 标本处理160例原发性肺癌患者通过手术切除或纤支境检查等活检技术获取新鲜病理组织标本，离体标本30 min内放入商品化的10%中性福尔马林溶液固定。溶液与标本体积大于10:1，手术标本固定时间为6～12 h，活检标本为4～8 h。病理组织标本处理程序包括标本收取、石蜡包埋、切片、HE染色、病理组织细胞形态、免疫组化检查评估等，从而明确肺癌病理诊断。肿瘤标志物检测需空腹采取静脉血标本5 mL送检。

1.2.3 DNA提取与检测从新鲜病变组织中取样应确定至少含有30%肺癌病变组织，将石蜡包埋病理组织或切片样品厚度切成5 μm，取3～8片，选用厦门艾德生物医药科技公司的核酸提取试剂提取人类基因组DNA，所提样本DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，DNA纯度的OD260/280比值为1.8～2.0，提取完的DNA建议立即进行检测，否则置于-20℃以下保存。人类EGER基因突变检测试剂盒检测方法操作流程按照说明书进行。

1.3 统计学方法应用SPSS21.0统计软件进行数据分析，率的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者临床资料及组织病理学分类160例肺癌患者中，男性89例(55.62%)，女性71例(44.38%)。89例男性患者中，吸烟者56例(62.92%)，无吸烟33例(37.08%)；56例男性吸烟者中，按吸烟指数(每天吸烟支数×吸烟年数)计数为：400以下者11例，400～600者20例，700～800者19例，800以上者6例。71例女性患者中吸烟者2例(2.82%)，其吸烟指数均在200以下；无吸烟69例(97.18%)。160例肺癌患者按组织细胞形态和免疫组化检测结果分类，主要分为腺癌142例(88.75%)、鳞癌10例(6.25%)、其他8例(5%)等类别，其他类中包括腺磷癌、类癌、肉瘤样癌等。

2.2 EGER基因突变检测情况160例肺癌患者中，EGER基因野生型为78人次(47.56%)，EGER基因突变型为86人次(52.44%)，突变型中21L858R点突变为38人次(23.17%)，19Del突变为37人次(22.56%)。在89例男性肺癌患者中，共有4例患者EGER基因同时检测到存在两个位点突变。其EGER基因突变详细情况，见表1。

表1160 例原发性肺癌患者EGFR基因突变检测结果

2.3 肿瘤标志物表达情况肿瘤标志物系列检测包括细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、鳞状上皮癌相关抗原(SCC)、神经元特异烯醇(NSE)、糖类抗原-125 (CA125)、糖类抗原-153(CA153)、糖类抗原-199 (CA199)、糖类抗原-724(CA724)、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)。在明确肺癌病理诊断后，将160例肺癌患者每一例在住院过程中历次肿瘤标志物检测结果汇总做纵向统计，将超过正常参考值的作为阳性，计算其阳性率。所检测肿瘤标志物按阳性率高低排序为：CYFRA21-1为65.36%(351/537)、CEA为65.04% (346/532)、CA125为56.23%(203/361)、CA153为38.27%(137/358)、CA724为31.78%(116/365)、CA199为19.40%(71/366)、NSE为15.67%(84/536)、SCC为8.79%(47/535)、AFP为8.52%(31/364)。EGER基因21L858R突变肺癌患者较19Del突变肺癌患者肿瘤标志物CEA阳性率高(71.97%和64.86%)，差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

2.4 肺癌患者EGER基因突变与肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1浓度梯度关联性从以上119例具备完整肿瘤标志物检测系列的原发性肺癌患者中剔除4例双位点突变患者后余115例，按肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1首诊检测结果以浓度梯度分层，结果见表3和表4。

表2 原发性肺癌患者EGFR基因突变与肿瘤标志物表达阳性率(%)

表3 115例原发性肺癌患者EGFR基因突变与CEA浓度梯度的关联性(例)

表4 115例原发性肺癌患者EGFR基因突变与CYFRA21-1浓度梯度的关联性(例)

3 讨论

表皮生长因子受体(EGER)是原癌基因(erbB1/ HER1也即EGER基因)的表达产物[2]，定位于细胞膜上，EGER由胞外的配体结合区、疏水跨膜结合域和胞内的蛋白酪氨酸激酶区三部分组成[3]。EGER主要通过两条途径将信号传递至细胞核，一条是Ras-Raf-MAPK途径，另一条是PI3K-PKC-IKK途径，当信号传导至细胞核后，引起核内基因转录水平的增加，使细胞增殖、转化，EGER信号传导的异常是包括原发性肺癌等多种肿瘤发生的原因。EGER基因位于人类7号染色体的短臂上，由188 307个碱基组成，包括28个外显子，其酪氨酸激酶功能区由外显子18-24编码，研究发现一些患者EGER基因的编码区，主要是在外显子18～21上发生突变，而这些突变与表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGER-TKI)如吉非替尼、厄洛替尼药物反应性有关。

根据“二次打击学说”[4]，肺癌是亲代遗传获得易感变异基础上，环境致癌因素长期作用，支气管黏膜上皮细胞EGER、KRAS、BRAF等基因突变积累形成。对于一个特定个体来说，其体内所有类型的细胞均含有同样一套基因组，而人类各个体基因组存在大量的变异和多态性，这种基因序列差异(包括单核苷酸多态性SNP、短串联重复序列STR和拷贝数目变异CNV)构成不同个体对疾病易感性和对药物、环境因素等不同反应的分子基础。在本研究中，统计结果显示，89例男性肺癌患者中吸烟者占比62.92%(56/89)，非吸烟者占比37.08%(33/89)；71例女性肺癌患者中吸烟者占比2.82%(2/71)，非吸烟者占比97.18%(69/ 71)。说明环境因素(如吸烟)是否致肺癌，存在着个体易感性差异区别。“二次打击学说”就是对以上实践现象贴切的理论解释。如何通过对人群中由亲代遗传而来的胚系细胞肺癌易感基因的检测，从而从分子水平上开展肺癌致病的早期“精准预测”与“精准预防”，值得研究者进一步思考、探索与挖掘。有关肺癌组织病理学分类方面，160例肺癌患者中腺癌占大部分，占比88.75%(142/160)，鳞癌占比6.25%(10/160)，其他类别占比5.00%(8/160)，其他类别包括腺磷癌、类癌、肉瘤样癌等。

肿瘤起源于一些未分化或微分化的干细胞，上皮细胞作为干细胞自我更新的组织和细胞类型，更容易发生癌变，据统计，目前人类肿瘤90%以上是上皮源性[5]。通过本试验原发性肺癌患者支气管黏膜上皮细胞EGER基因突变检测，从基因组学角度，可以发现经病理诊断确诊的160例原发性肺癌病例中，EGER基因突变型占比52.44%(86/164)，主要是21L858R点突变(占23.17%，38/164)和19Del突变(占22.56%，37/164)，突变率和突变情况与其他研究结果相近[6-8]，说明肺癌致病与EGER基因突变明确相关[9]。有占比47.56% (78/164)的患者EGER基因未发生突变，表现为野生型，是否存在其他基因突变，情况尚不明确。而18G719X、20T790M、20S768I、20Ins、21L861Q等位点突变频率较低，均属于低频突变。以上160例原发性肺癌EGER基因突变情况，为以后的肺癌基因诊断提供了依据。

根据分子生物学中心法则，遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译过程。在确诊的160例原发性肺癌病例中，已发现EGER驱动基因高频突变。那么，从蛋白质组学角度，肿瘤标志物系列检测也发现有显著高表达。经大样本检测统计，所检测肿瘤标志物按阳性率高低排序为：CYFRA21-1(351/537，65.36%)、CEA(346/ 532，65.04%)、CA125(203/361，56.23%)、CA153(137/ 358，38.27%)、CA724(116/365，31.78%)、CA199(71/366，19.40%)、NSE(84/536，15.67%)、SCC(47/535，8.79%)、AFP(31/364，8.52%)，说明原发性肺癌发病与肿瘤标志物表达存在明确正相关，肿瘤标志物检测有助于原发性肺癌的诊断，但只能起辅助诊断作用，而无确诊价值。肿瘤标志物CYFRA21-1、CEA阳性率较高，反映肺癌疾病的一致性较好，说明其检测灵敏度、诊断价值较高，但易于出现假阳性，在有关肺部良性肿块肿瘤标志物检测研究中，两者都有10%以上假阳性率[10-11]。相反，肿瘤标志物SCC阳性率较低，反映肺癌疾病的一致性较差，说明其检测灵敏度、诊断价值较低，易出现假阴性。同时将同一患者住院期间历次肿瘤标志物系列检测做比较，发现前后结果比较有极好的连贯性。提示对临床中常碰到的肿瘤标志物检测结果阳性病例，而对其诊断意义有疑问时，可通过动态检测、观察来厘清。在临床工作中，肿瘤标志物检测结果的解读，除观察是否超过正常参考值，作阴阳性判别外，其数值高低对提示诊断也有价值。一般来说，数值越高、偏离正常参考值越多、越具有肯定诊断价值。160例肺癌病例中，具备以上完整肿瘤标志物系列检测组合的119例患者的首诊检测结果按同时阳性个数做横向比较，发现全部阴性共有4例，占比3.36%(4/119，P＜0.05)，属小概率事件。单个肿瘤标志物阳性占比19.32%(23/119)，多个肿瘤标志物阳性占比77.32%(92/119)，其中同时三个肿瘤标志物阳性占比最高(28/119，23.53%)。以上结果说明，肿瘤标志物检测在原发性肺癌诊断中有明确的价值。而且，如果进行单个肿瘤标志物检测，将存在极高漏诊率，通过肿瘤标志物系列检测组合进行检测，可提高肺癌诊断准确性，降低漏诊率。

如上所述，在原发性肺癌中，大约2/3患者肿瘤标志物CEA存在阳性表达。表3所示在74例阳性表达患者中，5 ng/mL≤CEA＜20 ng/mL占37.84%(28/74)，CEA＞20 ng/mL占62.16%(46/74)，说明CEA表达浓度较高。分子生物学理论上有“一个基因一种多肽”假说，那么一个基因中不同位点突变又会有何种影响？有关EGER基因不同突变位点与肿瘤标志物CEA表达的关联方面，表2中，EGER基因21L858R突变肺癌患者CEA阳性率为71.97%(95/132)，19Del突变肺癌患者CEA阳性率为64.86%(72/111)，差异无统计学意义(P＞0.05)。EGER基因21L858R突变肺癌患者CEA阳性率为74.07%(20/27)，19Del突变肺癌患者CEA阳性率为57.69%(15/26)，差异未统计学意义(P＞0.05)，计算方法不同，但结论一致。说明CEA表达浓度差异较小，属于微调，而非决定性的。但两种计算方法均显示EGER基因21L858R突变肺癌患者较19Del突变肺癌患者CEA阳性表达率高，是否提示EGER基因21L858R位点突变，促使调控序列包括启动子、增强子功能上调，使EGER基因编码序列作用加强，从而与肿瘤标志物CEA高表达存在某种内在联系，尚未能下定论。其次，有关CEA浓度梯度与EGER基因突变关联方面，发现随着CEA浓度梯度的递增，EGER基因突变率也递增。有研究认为EGER基因突变率随着术前血清CEA的升高而增加，在没有条件获得EGER基因突变的情况下，对于CEA表达水平增高的NSCLC患者，认为其有较高EGER基因突变率，可以尝试使用EGER-TKI，会有生存获益[12]。但如上所述，在本研究中未能获得足够、可靠的依据支持该结论。

有关肿瘤标志物CYFRA21-1的表达方面，肿瘤标志物CYFRA21-1阳性率较高，在表2总样本中CYFRA21-1阳性率为65.36%(351/537)，表4中CYFRA21-1阳性率为69.57%(80/115)，数值接近。但其表达浓度较低，表4中80例阳性表达患者，CYFRA21-1＜20 ng/mL占80.00%(64/80)，CYFRA21-1＞20 ng/mL占20.00%(16/80)。其中50 ng/mL＜CYFRA21-1＜200 ng/m者只有5例。有关EGER基因不同突变位点与肿瘤标志物CYFRA21-1表达的关联方面，表2中，EGER基因21L858R突变肺癌患者CY-FRA21-1阳性率为70.77%(92/130)，19Del突变肺癌患者CYFRA21-1阳性率为57.66%(64/111)，两者间差异无统计学意义。表4中，EGER基因21L858R突变肺癌患者CYFRA21-1阳性率为70.37%(19/27)，19Del突变肺癌患者CYFRA21-1阳性率为69.23%(18/26)，CYFRA21-1阳性率两者基本相同。有关CYFRA21-1浓度梯度与EGER基因突变关联方面，发现CYFRA21-1各浓度梯度之间EGER基因突变率甚为接近，各分层之间EGER基因突变率几乎无差别。总体来说，EGER基因21L858R与19Del不同位点突变的肺癌患者，其肿瘤标志物表达有些微差别，但不显著，其内在调控因素、关联比较复杂。因此，有关EGER基因不同位点突变与肿瘤标志物表达的关联，仍需要进一步探索、研究。

本试验通过检测肺癌病理组织支气管黏膜上皮体细胞DNA中EGER基因突变，现阶段其检测目的主要是为肺癌的分子靶向治疗提供依据，但也存在技术局限，检测的靶基因为单个基因，实验所使用的ARMS-PCR技术，可以检出10 ng DAN样品中含量低至1%的基因突变[13]，但只能检测已知位点突变。而下一代测序(NGS)技术可以检出突变丰度在0.01%～0.1%的突变[14]，检测灵敏度更高。同时既可检测已知位点突变，也可检测未知位点突变。一般认为，肺癌是多基因异常引起的恶性疾病，通过多基因检测更能反映疾病的全貌。因此从肺癌致病与基因突变关联分析，从诊断的角度，更趋向于进行多基因突变检测，甚至是全外显子组或全基因组检测。其次，从检测标本的采取着眼，通过高效的富集、捕获技术检测外周血微量循环肿瘤DNA(ctDNA)或循环肿瘤细胞(CtCs)，即所谓的液体活检技术来进行肿瘤体细胞多基因突变检测、诊断，是当前的发展趋势和研究热点[15-16]。通过以上研究有望提供简便的、有创新性的检测技术、手段和方法应用于临床，对临床影像学检查发现肺部占位疑难病例，通过液体活检技术进行基因突变检测，同时进行肺癌肿瘤标志物系列检测，以辅助临床诊断，确认或排除肺癌，并为进一步治疗手段的选择提供依据。从而从分子病理学角度来推动肺癌的精准预防、预测、基因诊断和治疗。

综上所述，原发性肺癌患者中存在高频EGER基因突变和系列肿瘤标志物高表达，EGER基因突变型中，以21L858R和19Del占大多数，突变型中女性多于男性。通过EGER基因突变和系列肿瘤标志物检测，将为肺癌的诊断和治疗方法的选择提供依据。

[1]Chen W,Zheng R,Zeng H,et al.Annal report on status of cancer in China[J].Chin J Cancer Res,2015,27(1):2-12.

[2]段国辰,郭涛.非小细胞肺癌EGER基因突变的研究进展[J].河北医药,2015,37(23):3637-3639.

[3]王冠军,赫捷.肿瘤学概论[M].北京:人民卫生出版社,2013: 200-207.

[4]周春燕,冯作化,药立波,等.医学分子生物学[M].2版.北京:人民卫生出版社,2014:232-234.

[5]梁颖,林勇平,徐韫健,等.非小细胞肺癌EGER基因突变的异质性[J].热带医学杂志,2015,15(12):1590-1594.

[6]张静,梁智勇,曾喧,等.应用蝎形探针扩增阻滞突变系统检测非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变与病理改变的关系[J].中华病理学杂志,2008,37(5):294-299.

[7]赵静,赵金银,赵肖,等.ARMS技术联合Taqman探针检测100例非小细胞肺癌EGER基因突变[J].中国肺癌杂志,2013,16(1): 25-32.

[8]邱田,凌云,山灵,等.非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体Kras基因突变检测及与临床病理特征的相关性[J].中国肿瘤临床与康复, 2015,22(6):678-680.

[9]郑军,谢贵元,李姣,等.非小细胞肺癌EGER基因突变的临床意义研究[J].中国肿瘤临床,2014,41(14):904-907.

[10]王鑫蕊,刘旭.肺癌肿瘤标志物的研究现状[J].国际检验医学杂志, 2015,36(23):3457-3459.

[11]郑名华,孙国栋,张郧樊,等.肿瘤标志物在肺癌诊疗中的研究进展[J].中国医学创新,2016,13(4):145-148.

[12]王进峰,龙浩.非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变与癌胚抗原表达水平的关系[J].广东医学,2012,33(11):1589-1592.

[13]Shama Sv,Bell DW,Seltleman J,et al.epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer[J].Nat Rev Cancer,2007,7(3):69-81.

[14]Tenressen JA,Bigham AW,O`connor TD,et al.Evolution and functional impact of rare coding variation from deep sequencing of human exons[J].Science,2012,337(6090):64-69.

[15]Yasuda H,S Kobay shi,Costa D B,et al.EGER exon 20 insertion mutations in non-small-cell lung cancer preclinical data and clinical caplications[J].Lancer Oncol,2012,13(1):e23-31.

[16]非小细胞肺癌血液EGER基因突变检测中国专家共识制订专家组.非小细胞肺癌血液EGER基因突变检测中国专家共识[J].中华医学杂志,2015,95(46):3721-3725.

Association of EGFR gene mutation with tumor marker expression and its value in the diagnosis of primary lung cancer.

ZOU Chuan-wei1,WANG Xiao-pai2,ZHOU Li-xia3.Department of General Internal Medicine1,Department of Pathology2,Department of Cardio-Thoracic Surgery3,Guangzhou First People's Hospital,Guangzhou 510000,Guangdong, CHINA

ObjectiveTo investigate the association of epidermal growth factor receptor(EGER)gene mutation with the expression of tumor markers in patients with primary lung cancer,and to provide evidence for the prevention,prediction,diagnosis and treatment of lung cancer.MethodsThe fresh pathological tissue specimens were collected from 160 patients with primary lung cancer who admitted to Guangzhou First People′s Hospital from March 2014 to December 2015.Somatic cell DNA were extracted with Xiamen AmoyDx®DNA and RNA Extraction Kits.Then ARMS-PCR technique was used to detect EGER gene mutations.The series of tumor markers were detected by taking the peripheral venous blood with chemiluminescence method,then the data were analyzed statistically.ResultsIn 160 primary lung cancer patients,EGER gene wild type rate was 47.56%(78/164),and EGER gene mutation type rate was 52.44%(86/164)．For EGER gene mutation type,the proportion of 21L858R mutation was 23.17%(38/164),and that of 19Del mutation was 22.56%(37/164)．The detection of tumor markers sorted by positive rate as followes:65.36%(351/ 537)of CYFRA21-1,65.04%(346/532)of CEA,56.23%(203/361)of CA125,38.27%(137/358)of CA153,31.78% (116/365)of CA724,19.40%(71/366)of CA199,15.67%(84/536)of NSE,8.79%(47/535)of SCC,8.52%(31/364)of AFP．Tumor markers CEA positive rate in lung cancer patients of EGER gene 21L858R mutations was 71.97%,which was higher than 64.86%in patients with 19Del mutations(P＞0.05).As the CEA concentration gradient increasing,EGFR gene mutation rate was also increasing.ConclusionLung cancer pathogenesis is closely related to EGER gene mutation and tumor marker overexpression.The detection of series of tumor markers and EGER mutation will contribute to the diagnosis and identification of lung cancer,and provide the basis for lung cancer treatment．

Pulmonary malignant tumor;Epidermal growth factor receptor(EGER)gene;Gene mutation;Tumor markers

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.005

R734.2

A

1003—6350（2017）15—2426—05

2017-05-03)

广东省科技计划项目(编号：2012B31800327)

邹传伟。E-mail：zcw.cz@163.com