海口市蚊媒分布及乙脑病毒分离鉴定

赵宣，侯乃旭，陈晨，张琪悦，赵静，芦亚君

(1.热带病转化医学教育部重点实验室海南医学院，海南海口571199；2.海南医学院热带医学与检验医学院，海南海口571199)

海口市蚊媒分布及乙脑病毒分离鉴定

赵宣1，2，侯乃旭1，2，陈晨1，2，张琪悦1，2，赵静1，2，芦亚君1，2

(1.热带病转化医学教育部重点实验室海南医学院，海南海口571199；2.海南医学院热带医学与检验医学院，海南海口571199)

目的调查海口市吸血蚊媒分布及蚊虫携带乙脑病毒的情况。方法于2015年7月至2016年6月采用帐诱法捕捉蚊虫，用细胞培养法分离病毒，磁珠法提取病毒RNA、RT-LAMP扩增，并进行分子生物学鉴定。结果于海口市捕捉蚊虫共561只，其中库蚊528只，占94.12%，伊蚊33只，占5.88%；库蚊研磨液接种于BHK21产生典型的细胞病变，RT-LAMP扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定显示，蚊媒体内乙脑病毒阳性。结论海口市存在携带乙脑病毒的吸血蚊媒。

流行性乙型脑炎病毒(乙脑病毒)；蚊媒；海口

流行性乙型脑炎(epidemic encephalitis type B)又称日本乙型脑炎(Japanese B encephalitis)，是一种严重损害中枢神经系统的急性传染病。其病原体是流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，简称乙脑病毒，隶属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，是一种有囊膜的似球形病毒，可破坏神经系统，对人体伤害巨大[1]。流行性乙型脑炎的传播媒介主要为吸血蚊虫[2]，常见带毒蚊种有三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)、淡色库蚊(Culex pipiens pallens)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)、中华按蚊(Anopheles sinensis)和骚扰阿蚊(Armigeres subalbatus)等。其中分离出病毒最多的蚊种为三带喙库蚊。自建国以来文献记载[3-10]，海南省曾发生多次乙脑爆发。乙脑病例主要在儋州市、三亚市、乐东县等地，其他市县存在散发病例。本研究于2015年7月至2016年6月在海南省海口市进行蚊虫采集，调查蚊虫种类、密度及携带乙脑病毒情况。

1 材料与方法

1.1 相关试剂及仪器BHK21(幼仓鼠肾细胞)、FBS(胎牛血清)、MEM培养液购于武汉博士德生物工程有限公司；病毒RNA提取试剂盒(磁珠法)购于北京百泰克生物技术有限公司；DNA Ladder DL2000购于江苏凯基生物技术股份有限公司；核酸染料SYBR Green(10 000×)购于北京索莱宝科技有限公司；Bst DNA聚合酶大片段购于纽英伦生物技术(北京)有限公司；引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；高效组织细胞破碎仪购于湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司；小型台式高速冷冻离心机Eppendorf 5424R购于艾本德中国有限公司；L1型低温连接仪购于珠海黑马医学仪器有限公司；Thermo fisher超微量分光光度计Nano Drop 2000购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司；全自动数码凝胶成像分析系统Tanon-1600购于上海天能科技有限公司。

1.2 蚊媒采集2015年7月至2016年6月，选择在海口市人口流动量大的火车东站、汽车东站、汽车南站和汽车西站作为捕蚊点，采用帐诱法在傍晚连续捕蚊1 h。待蚊虫胃血消化殆尽，-80℃保存。

1.3 蚊虫处理及细胞染毒于冰板上进行蚊种鉴别，并分类计数。50只一批，放入装有研磨珠的研磨管内，加2 mL 4℃预冷的MEM，置高效组织细胞破碎仪内，以4 000 r/min研磨破碎两次，每次20 s，充分研磨至组织碎片消失呈匀浆状；4℃12 000 r/min离心20 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，取500 μL滤液接种于BHK21细胞，置于37℃CO2培养箱内，每15 min晃动一次，使蚊虫研磨液与细胞充分接触，染毒1 h后弃去蚊研液，加10%FBS MEM进行细胞常规培养，每12 h观察一次，BHK21细胞是否出现细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，如有CPE，则为阳性反应；如无CPE，继续传代培养三次，仍无病变，则为阴性[11-12]；

1.4 病毒RNA提取及扩增

1.4.1 病毒RNA提取取200 μL CPE细胞悬液，用病毒RNA提取试剂盒(磁珠法)提取RNA；使用超微量分光光度计测定RNA含量及纯度。

1.4.2 引物设计及合成乙脑病毒RNA RT-LAMP扩增引物共6条[13]，包括2条外引物F3/B3，2条内引物FIP/BIP，2条环引物FLP/BLP(表1)，由上海生工合成。

表1 乙脑病毒RT-LAMP引物序列

1.4.3 RT-LAMP扩增病毒RNA使用逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)扩增病毒RNA[14-15]，25 μL，反应体系(表2)，65℃孵育70 min，80℃20 min终止反应。

表2 RT-LAMP反应体系

1.5 病毒RNA扩增产物检测及鉴定

1.5.1 扩增产物初步检测于RT-LAMP扩增产物加1 μL SYBR green，混匀震荡，避光室温充分结合30 min，置于紫外成像系统观察是否产生强烈的荧光；等量RNase-free水与1 μL SYBR green结合作为阴性对照。

1.5.2 扩增产物鉴定取5 μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

2 结果

2.1 蚊媒种类及密度2015年7月至2016年6月在海口市四个蚊虫捕捉点共捕获蚊虫561只(表3)，平均蚊密度为11.69只/h。库蚊528只，占94.12%，1月份、4月份、10月份为库蚊密度高峰(图1)；伊蚊33只，占5.88%，5月份和9月份为伊蚊高峰(图2)。

表3 海口市2015年7月至2016年6月蚊媒种类、数量及密度

图12005 年7月至2016年6月库蚊分布

图22005 年7月至2016年6月伊蚊分布

2.2 病毒分离BHK21细胞接种蚊研液后，倒置显微镜(10蚊研液)下观察出现CPE，为阳性反应(图3)。

2.3 病毒鉴定

2.3.1 扩增产物初步检测RT-LAMP扩增产物与核酸染料SYBR green充分结合后，在紫外成像系统照射下阳性反应呈显著荧光，阴性反应无荧光，阴性对照管也无荧光(图4)。

2.3.2 扩增产物电泳鉴定含乙脑病毒RNA的扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后紫外成像系统下呈特异性明亮条带(图5)。

图3 CPE细胞

图4 RT-LAMP产物初步检测

图5 RT-LAMP产物电泳鉴定

3 讨论

海南省位于中国的最南处，属于热带海洋性季风气候，气候温暖潮湿，非常适宜蚊虫的孳生及繁殖。同时在国际旅游岛的建立和一带一路政策背景的推进下，海南省的旅游、贸易和人员来往与日俱增。人员流量激增、旅游业的发展、气候和环境的变化，为蚊媒传染病提供了有利的传播条件，出现严重的疾病传播隐患。海口市作为省会城市，具有人口密度大和人员流动量高的特点，极利于蚊媒病的传播和扩散。

本研究于2015年7月至2016年6月，在海南省海口市人口流动量大的四个捕蚊点进行为期一年的蚊媒采集，其中库蚊占94.12%，为优势蚊种，伊蚊仅占5.88%。平均蚊媒密度为11.69只/h，比2012-2014的1.79只/h[16]高出6.53倍。经细胞染毒培养和分子生物学鉴定显示，已从该批蚊虫中分离出乙脑病毒。以往资料显示，乙脑病例主要分布在儋州市、乐东县等地，且发病季节早于全国2个月。自2001年全省开始建立乙脑监测系统后，至2014年共确诊乙脑病例143例。虽然海口市至今尚未有乙脑病例报道，但蚊媒体内确有乙脑病毒存在，对当地人群具有潜在威胁。

因此，对病媒生物蚊虫的种类、密度、病原体携带情况进行系统调查和及时监测，才能为乙脑疾病及其他蚊媒传染病的预防和控制提供详实依据和针对性措施。

[1]Yun SI,Lee YM.Japanese encephalitis:the virus and vaccines[J]. Hum Vaccin Immunother,2014,10(2):263-279.

[2]Schuh AJ,Ward MJ,Brown AJ,et al.Phylogeography of Japanese encephalitis virus:genotype is associated with climate[J].PLoS Negl Trop Dis,2013,7(8):e2411.

[3]闫秀娟,孙莲英,曾雪霞.海南省2008年流行性乙型脑炎监测系统运行效果分析[J].中国热带医学,2009,9(10):2027-2028.

[4]陈少明,曾雪霞,马焱,等.海南省2009年流行性乙型脑炎监测分析[J].中国热带医学,2012,12(1):46-48.

[5]曾雪霞,孙莲英,邓海英,等.海南省流行性乙型脑炎病例监测系统建立及流行病学调查[J].中国热带医学,2005,5(3):423-425.

[6]潘先海,孙莲英,王春雷,等.海南省流行性乙型脑炎不同时期流行特征分析[J].中华流行病学杂志,2009,30(5):471-474.

[7]闫秀娟,孙莲英,李丹丹,等.海南省流行性乙型脑炎监测系统及效果评价[J].中国公共卫生,2009,25(3):316-317.

[8]符艳,黎正伦,王春雪,等.海南省一起流行性乙型脑炎暴发的调查分析[J].中国热带医学,2002,2(1):105-107.

[9]闫秀娟,赵伟,曾祥洁,等.海南省西南部地区流行性乙型脑炎媒介三带喙库蚊季节消长与宿主动物感染状况调查[J].中国媒介生物学及控制杂志,2008,19(5):470-471.

[10]孙莲英,闫秀娟,曾祥洁,等.海南省2006年流行性乙型脑炎监测结果分析[J].中国热带医学,2007,7(9):1514-1516.

[11]陈维欣.山东省蚊虫及蚊传虫媒病毒分布研究[D].济南:山东大学,2011.

[12]Mei L,Wu P,Ye J,et al.Development and application of an antigen capture ELISA assay for diagnosis of Japanese encephalitis virus in swine,human and mosquito[J].Virol J,2012,9:4.

[13]杜鹃.流行性乙型脑炎病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立[D].哈尔滨:黑龙江大学,2010.

[14]Liu H,Liu ZJ,Jing J,et al.Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Japanese encephalitis virus in swine and mosquitoes[J].Vector Borne Zoonotic Dis,2012,12 (12):1042-1052.

[15]Wongsawat K,Dharakul T,Narat P,et al.Detection of nucleic acid of classical swine fever virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP)[J].Health,2011,3(7):447-452

[16]王晓花,杨新艳,赵伟,等.海口市2012-2014年蚊虫密度监测结果分析[J].中国媒介生物学及控制杂志,2008,26(4):424-426.

Distribution of mosquito vectors and isolation and identification of Japanese encephalitis virus in Haikou City.

ZHAO Xuan1,2,HOU Nai-xu1,2,CHEN Chen1,2,ZHANG Qi-yue1,2,ZHAO Jing1,2,LU Ya-jun1,2.1.Key Laboratory of Translation Medicine Tropical Diseases,Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA;2.College of Tropical Medicine and Laboratory Medicine,Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the distribution of blood-sucking mosquitoes and the situation of mosquitoes carrying Japanese encephalitis virus in Haikou City.MethodsThe mosquitoes were caught by mosquito net from July 2015 to June 2016.The viruses were isolated by cell culture and RNAwere extracted by paramagnetic particle method.RT-LAMP was used for molecular biological identification.ResultsA total of 561 mosquitoes were collected,of which 94.12%were Culex(528)and 5.88%were Aedes mosquito(33).The cell pathological effects were observed in BHK21 inoculated grinding fluid of Culex.RT-LAMP amplification products were tested by electrophoresis with 1% agarose gel,which showed that Japanese encephalitis virus in Culex was positive.ConclusionThere are mosquitos carrying JEV in Haikou City.

Japanese encephalitis virus(JEV);Mosquito vector;Haikou City

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.020

R512.32

A

1003—6350（2017）15—2478—03

2017-01-18)

海南省大学生创新创业训练计划项目(编号：HYCX20140109)

芦亚君。E-mail：luyajuncc@163.com