p75NTR对乳腺癌耐药细胞MDA-MB-231/ADR耐药及细胞周期的影响

邓晓芳，徐岗，何利珍

(广州医科大学附属肿瘤医院内二科1、胸外科2、病理科3，广东广州510095)

p75NTR对乳腺癌耐药细胞MDA-MB-231/ADR耐药及细胞周期的影响

邓晓芳1，徐岗2，何利珍3

(广州医科大学附属肿瘤医院内二科1、胸外科2、病理科3，广东广州510095)

目的探讨神经营养因子受体(p75NTR)对乳腺癌耐药细胞MDA-MB-231/ADR化疗耐药性及细胞周期的影响。方法采用CCK-8法检测转染p75NTR及p75NTR-siRNA后乳腺癌耐药细胞系MDA-MB-231/ ADR对耐药的影响；FCM检测转染p75NTR及p75NTR-siRNA的乳腺癌及耐药细胞的细胞周期分布及细胞凋亡的影响。结果过表达p75NTR可有效增强MDA-MB-231/ADR细胞对ADM、GEM和OXA的耐药性(P＜0.05)；抑制p75NTR的表达可抑制MDA-MB-231/ADR细胞对ADM、GEM和OXA的耐药性(P＜0.05)。转染pcDNA3.1-p75NTR后，MDA-MB-231/ADR-p75NTR细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期，G0/G1期细胞增至(61.12± 1.89)%，S期细胞减至(32.76±0.23)%，凋亡率减至(16.83±1.29)%，差异有统计学意义(P＜0.05)；转染p75NTR-siRNA后MDA-MB-231/ADR-p75NTRsi1细胞的细胞周期于G0/G1期减至(39.26±1.31)%，S期细胞增至(52.88±1.74)%，凋亡率增至(21.49±1.41)%,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论过表达p75NTR能够使乳腺癌耐药细胞MDA-MB-231/ADR细胞周期阻滞于G0/G1期，促进细胞存活，抑制其凋亡，降低MDA-MB-231/ADR细胞对化疗药物的敏感性而促进其多药耐药性。

乳腺癌；神经营养因子受体；多药耐药；细胞周期

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，在国内发病率每年增加约3%[1]。提高乳腺癌的治疗疗效是目前亟待解决的问题之一。特别是三阴型乳腺癌，恶性程度高、进展快、侵袭性强，更易复发和转移。三阴型乳腺癌的分子靶向治疗作为一种新的治疗方式正逐渐得到研究和应用[2]。神经营养因子受体(the neurotrophins receptor p75，p75NTR)是神经营养因子受体，本小组在前期研究中发现p75NTR的表达可能与三阴乳腺癌及Luminal B亚型相关[3]，并利用基因重组技术，构建了p75NTR的正义及反义表达载体，成功转染至乳腺癌耐药细胞MDA-MB-231/ADR中[4]。但p75NTR与乳腺癌耐药之间的关系尚未完全明确，本研究拟进一步以p75NTR为靶点，对转染后细胞进行耐药性、细胞周期及凋亡等方面的研究，探讨其可能影响乳腺癌耐药细胞耐药的部分机制。

1 材料与方法

1.1 材料乳腺癌细胞系MDA-MB-231购于军事科学研究院，乳腺癌耐药细胞系MDA-MB-231/ ADR由本所建立；RPMI1640培养基、胎牛血清购自Gibco；阿霉素(ADM)购自深圳万乐药业公司；吉西他滨(GEM)购自江苏豪森药业公司；奥沙利铂(OXA)购自山东齐鲁药业公司；ECL Western blot检测试剂盒购自Amersham公司。

1.2 细胞培养MDA-MB-231细胞培养于含10%胎牛血清、青霉素(100 μg/mL)、链霉素(100 μg/mL)的RPMI1640培养液，MDA-MB-231/ADR在上述培养条件下，加入1.0 μg/mLADM培养，细胞置于含5% CO2饱和湿度，37℃培养箱中培育。实验前2周更换为不含ADM的RPMI1640培养液，经3～4次传代后，取对数生长细胞进行实验。

1.3 CCK-8法检测p75NTR对MDA-MB-231/ ADR细胞耐药性的影响取对数生长期的各转染细胞，制备成单细胞悬液，记数细胞，调整细胞密度为6× 104个/mL，每孔100 μL接种于96孔板中。实验分成四组：MDA-MB-231/ADR-p75NTR组、MDA-MB-231/ ADR-pcDNA3.1组、MDA-MB-231/ADR-p75NTR-siRNA组、MDA-MB-231ADR-siRNA组；每组设3个复孔，细胞培养24 h后，分别加入不同浓度GEM(0.02 μg/mL、0.2 μg/mL、2 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL、128 μg/mL)、OXA(0.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL、240 μg/mL)和ADM(0.2 μg/mL、2 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100、150 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL)；在培养箱中培养48 h，检测各组细胞的OD值，计算细胞增殖抑制率(IR)，IR=(1-药物组OD值/对照组OD值)×100%，得到半数抑制浓度(IC50)值。

1.4 FCM法检测p75NTR对MDA-MB-231/ ADR细胞周期的影响取对数生长期的各转染细胞，制备成单细胞悬液，调整细胞密度为6×104个/mL，接种于6孔板中，2 mL/孔。实验分组同1.3部分。每组设3个复孔，细胞培养24 h后，分别加入同一浓度(按1.3的方法获得的IC50值的浓度)的ADM；继续培养48 h，收集细胞用PBS洗涤3次，上流式细胞仪检测。

1.5 FCM检测p75NTR对MDA-MB-231/ADR细胞凋亡改变的影响取对数生长期的各转染细胞，实验分组同1.3部分。培养、收集、洗涤并重悬细胞，加入5 μL Annexin VFITC，轻轻振荡混匀，室温避光孵育10 min，再加入5 μL PI，室温避光孵育5 min，轻轻振荡混匀，上流式细胞仪检测。

1.6 统计学方法应用SPSS19.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差()表示，两样本均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8法检测p75NTR对MDA-MB-231/ ADR细胞耐药性的参与作用CKK-8检测结果(表1)显示，MDA-MB-231/ADR对ADM、GEM和OXA均显示其耐药性。转染pcDNA3.1-p75NTR后，MDA-MB-231/ADR-p75NTR、MDA-MB-231-p75NTR细胞对三种抗肿瘤药物的耐药性增强，差异有统计学意义(P＜0.05)；转染p75NTR-siRNA后MDA-MB-231/ ADR-p75NTRsi1、MDA-MB-231-p75NTRsi1细胞对三种抗肿瘤药物的敏感性增强，差异有统计学意义(P＜0.05)；结果提示过表达p75NTR可有效增强MDA-MB-231/ADR细胞对ADM、GEM和OXA的耐药性；抑制p75NTR的表达可抑制MDA-MB-231/ ADR细胞对ADM、GEM和OXA的耐药性。

表1 p75NTR对乳腺癌耐药细胞MDA-MB-231/ADR耐药的参与作用

表1 p75NTR对乳腺癌耐药细胞MDA-MB-231/ADR耐药的参与作用

组别孔数IC50(μg/mL) MDA-MB-231/ADR-p75NTR MDA-MB-231/ADR-pcDNA t值P值MDA-MB-231/ADR-pSilencer MDA-MB-231/ADR-p75NTRsi1 t值P值3 3 3 3 ADM 183.37±4.45 124.28±4.94 8.31＜0.05 124.48±4.35 66.9±3.17 13.15＜0.05 GEM 25.43±2.15 12.13±2.02 9.76＜0.05 13.24±1.86 7.36±1.43 15.48＜0.05 OXA 65.72±1.85 38.45±1.56 11.78＜0.05 40.15±1.73 28.17±1.42 12.86＜0.05

2.2 p75NTR对MDA-MB-231/ADR细胞周期影响FCM检测结果(图1和表2)显示，转染pcDNA3.1-p75NTR后，MDA-MB-231/ADR-p75NTR细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期，于G0/G1期增多，S期细胞减少；转染p75NTR-siRNA后MDA-MB-231/ ADR-p75NTRsi1细胞组的细胞周期于G0/G1期减少，S期细胞增多，两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1 FCM检测p75NTR对MDA-MB-231/ADR细胞的细胞周期分布影响

图2 FCM检测p75NTR对MDA-MB-231/ADR细胞的凋亡的影响

表2 p75NTR对MDA-MB-231/ADR细胞的周期分布及凋亡的影响

表2 p75NTR对MDA-MB-231/ADR细胞的周期分布及凋亡的影响

组别孔数细胞周期凋亡S MDA-MB-231/ADR-p75NTR MDA-MB-231/ADR-pcDNA t值P值MDA-MB-231/ADR-pSilencer MDA-MB-231/ADR-p75NTRsi1 t值P值3 3 3 3 G0/G161.12±1.89 51.57±1.28 3.68＜0.05 52.43±1.74 39.26±1.31 11.49＜0.05 32.76±0.23 42.68±1.37 4.51＜0.05 43.19±1.16 52.88±1.74 12.12＜0.05 G2/M 6.12±0.48 5.75±0.88 3.8＜0.05 4.38±0.73 7.86±1.02 16.09＜0.05 16.83±1.29 18.59±1.53 6.59＜0.05 20.57±1.65 21.49±1.41 7.24＜0.05

2.3 p75NTR对MDA-MB-231/ADR细胞凋亡的影响p75NTR可影响MDA-MB-231/ADR细胞凋亡。FCM检测结果(图2和表2)显示，转染pcDNA3.1-p75NTR后，MDA-MB-231/ADR-p75NTR细胞的凋亡率减少，存活率增多；转染p75NTR-siRNA后MDA-MB-231/ADR-p75NTRsi1细胞组的凋亡率增多，存活率减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

p75NTR又名神经生长因子受体(nerve growth factor receptor，NGFR)，定位于人染色体17q12-17q22，包含6个外显子，属于肿瘤坏死因子受体超家族的一员。现有研究表明p75NTR的表达有利于促进食管癌、乳腺癌细胞的生长和强烈抵制抗肿瘤治疗[5-6]，也可以作为生存受体促进黑色素瘤细胞的脑转移[7]。p75NTR阳性肿瘤表现了许多三阴型乳腺癌的特征，如高组织分化，高增殖指数及与肌上皮细胞标志物相关[8]。三阴型乳腺癌恶性程度高，易转移复发，临床治疗效果差，预后差[9]，推测可能与此机制有关。随着对p75NTR研究的深入，发现多种药物可通过作用于p75NTR起到调控肿瘤细胞耐药的作用[10-12]。通过用p75NTR的过表达载体上调乳腺癌细胞中p75NTR的表达；p75NTR特异性siRNA抑制乳腺癌细胞中p75NTR的表达，发现过表达p75NTR可有效增强MDA-MB-231/ADR细胞对ADM、GEM和OXA的耐药性；抑制p75NTR的表达可降低MDA-MB-231/ ADR细胞对ADM、GEM和OXA的耐药性。

恶性肿瘤的发生发展通常表现为细胞周期异常、细胞周期调控机制紊乱以及肿瘤细胞的无限增殖。G1/S期和G2/M期是细胞周期的关键点。Vrbeke等[13]的研究认为p75NTR的过表达，可上调p21，而p21是细胞周期cyclin/CDK抑制剂，抑制细胞从G1期到S期，使细胞停留在G0/G1期，处于慢周期或静息状态，对化疗药物敏感性下降，增加了细胞的耐药性。本研究发现p75NTR对MDA-MB-231/ADR细胞周期有一定影响，过表达p75NTR细胞可使细胞周期阻滞于G0/G1期，G0/G1期细胞比率高于MDA-MB-231/ ADR-pcDNA组，S期细胞比率亦低于后者；抑制p75NTR表达后MDA-MB-231/ADR-p75NTRsi1细胞组的细胞周期于G0/G1期细胞比率低于MDA-MB-231/ADR-pSilencer组，S期细胞比率高于后者。本结果提示，通过调节p75NTR的表达可影响耐药细胞周期进程从而在发病过程中发挥重要作用，过表达p75NTR使MDA-MB-231/ADR细胞周期阻滞于G0/G1期，增殖细胞不能通过“G1/S”调节点，处于慢周期或静息状态的细胞增多，细胞增殖延缓，对化疗敏感性下降，增加了细胞的耐药性。而抑制p75NTR的表达使MDA-MB-231/ADR细胞周期于G0/G1期减少，处于慢周期或静息状态细胞减少，细胞增殖加快，对化疗敏感性增加，从而逆转细胞的耐药性。

p75NTR可通过减少肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导的PARP和caspase3分解促进细胞的存活，且其促生存作用是独立的，与PI3-激酶，MAPK和NF-κB无关，提示p75NTR可通过多元通路发挥其促生存作用[14]。本研究FCM检测结果显示，过表达p75NTR的MDA-MB-231/ADR-p75NTR细胞凋亡率明显低于抑制p75NTR表达的MDA-MB-231/ ADR-p75NTRsi1细胞，证实过表达p75NTR细胞更能抵抗凋亡，而抑制p75NTR的表达使MDA-MB-231/ ADR-p75NTRsi1细胞的凋亡率增加。诱导细胞凋亡是绝大多数抗肿瘤药物杀伤肿瘤细胞的共同通路，凋亡受抑可能是肿瘤细胞产生耐药的机制之一，Asakura等[15]认为在凋亡过程中Bcl-2/Bax的比值参与调节线粒体渗透小孔使细胞色素C从线粒体释放到胞液，这与其他关于多药耐药性发生机制一样具有普遍意义。

综上所述，过表达p75NTR可有效增强MDA-MB-231/ADR细胞对ADM、GEM和OXA的耐药性，使MDA-MB-231/ADR细胞周期阻滞于G0/G1期，并更能抵抗细胞的凋亡，抑制p75NTR表达则呈相反的效应。这为p75NTR增强乳腺癌耐药细胞株MDA-MB-231/ADR耐药的研究提供实验依据，但其在细胞内通过何种分子信号转导通路参与了乳腺癌耐药细胞的耐药机制还需要进一步的研究。

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Effects of neurotrophin receptor p75NTR on drug resistance and cell cycle in breast cancer resistant cell line MDA-MB-231/ADR.

DENG Xiao-fang1,XU Gang2,HE Li-zhen3.Second Department of Internal Medicine1,Department of Thoracic Surgery2,Department of Pathology3,Cancer Center of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510095, Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects of neurotrophin receptor p75NTR on drug resistance and cell cycle in breast cancer resistant cell line MDA-MB-231/ADR.Methods The multi-drug resistance effects of the overexpression and knock-down p75NTR on breast cancer cell line MDA-MB-231/ADR were detected by CCK-8 assay.Flow cytometry(FCM)was used to detect the effects of the overexpression and knock-down of p75NTR on the cell cycles distribution and apoptosis.ResultsThe overexpression of p75NTR can effectively enhance the resistance of MDA-MB-231/ADR cells to Doxorubicin(ADM),Gentamicin(GEM)and Oxacillin(OXA)(P＜0.05).The inhibition of p75NTR expression can increase the sensitivity of MDA-MB-231/ADR cells to ADM,GEM and OXA(P＜0.05).After the transfection of pcDNA3.1-p75NTR,MDA-MB-231/ADR-p75NTR cell cycle arrested in G0/G1phase.The number of cells in G0/G1phase increased to(61.12±1.89)%and those in S phase decreased to(32.76±0.23)%.Additionally,apoptosis rate in S phase decreased to(16.83±1.29)%,P＜0.05.After the transfection of p75NTR-siRNA,the number of cells in G0/G1phase decreased to(39.26±1.31)%and those in S phase increased to(52.88±1.74)%.And apoptosis rate in S phase increased to(21.49±1.41)%(P＜0.05).ConclusionThe overexpression of p75NTR can make MDA-MB-231/ADR cell cycle arrest in G0/G1phase,promote cell survival,inhibit the apoptosis,reduce the sensitivity to chemotherapeutic drugs and promote its multidrug resistance.

Breast cancer;Neurotrophin receptor p75/p75NTR;Multidrug resistance;Cell cycle

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.002

R737.9

A

1003—6350（2017）15—2414—04

2017-05-17)

广东省卫生计生委医学科研基金(编号：B2016070)；广州医科大学科研资助项目(编号：2015C42)

邓晓芳。E-mail：dengxf2046@126.com